Заболевание вызванное вирусом коксаки: симптомы, лечение и профилактика турецкого гриппа

Филогенетический статус современного Штаммы CV-A6. (A) Дерево объединения соседей на основе короткой области генома CV-A6 (частичный VP1, положения с 2614 по 2866, соответствующие геному Gdula).Только топология показана для ясной демонстрации филогенетических отношений между штаммами. (B и C) Дерево объединения соседей на основе полноразмерных геномов CV-A6. В качестве ссылок использовались прототипы группы HEV-A, EV-D68 и полиовируса 1. Дерево показывает, что современные штаммы CV-A6 филогенетически близки к прототипу Gdula (B), в то время как поддерево указывает, что штаммы из Чанчуня имеют разное происхождение (C). Все деревья были протестированы методом начальной загрузки для 1000 повторов, и в узлах показаны значения> 70.●, изоляты CV-A6-Changchun.

Чтобы дополнительно охарактеризовать эти новые штаммы CV-A6, мы определили четыре полноразмерные вирусные последовательности CV-A6, представляющие три различных кластера, показанных на рис. 1A, то есть Changchun046, Changchun097, Changchun098 и Changchun099. Чтобы изучить филогенетические отношения между современными штаммами CV-A6 и другими членами группы энтеровируса человека A (HEV-A), были исследованы последовательности 34 дополнительных полноразмерных штаммов CV-A6 и прототипных штаммов, представляющих каждого члена группы HEV-A. получено из GenBank, включая прототип CV-A6 Gdula.Подобная стратегия успешно отделила циркулирующие штаммы CV-A16 от их прототипа, G-10, и в конечном итоге привела к открытию, что современный CV-A16 на самом деле является рекомбинантной формой (7). В отличие от CV-A16 (7), результирующее дерево NJ показало, что современный CV-A6 был эволюционно близок к прототипу CV-A6 Gdula и отличался от других членов группы HEV-A (Fig. 1B). Однако четыре последовательности Чанчуня были расположены в разных подкластерах (Рис. 1C). Changchun046 был тесно связан с другой ранее описанной последовательностью Changchun, CV-A6 / CC13 / 57, и оба могут иметь происхождение из Японии.Changchun097 и Changchun099 были филогенетически близки друг к другу, но отличны от Changchun098, тогда как последний мог иметь общего предка с последовательностями из Шанхая.

Циркулирующие штаммы CV-A6 вызывали дозозависимую заболеваемость и смертность in vivo . Чтобы найти патогенетический механизм и определяющую вирулентность область штаммов CV-A6, мы использовали модель летальных мышей. Чтобы определить, были ли штаммы CV-A6-Changchun летальными для новорожденных мышей, и измерить средние летальные дозы (LD ₅₀ ) этих вирусов, однодневным мышам внутримозгово вводили CV-A6-Changchun.Мышей случайным образом разделили на восемь групп и внутримозгово вводили (10 мкл / мышь) 10-кратные серийные разведения Changchun046 (от 10 ^5,0 до 10 ^2,0 Инфекционные дозы в 50% культуре клеток [CCID ₅₀ ] / мл). , Changchun097 (10 ^4,0 до 10 ^1,0 CCID ₅₀ / мл), Changchun098 (10 ^6,0 до 10 ^3,0 CCID ₅₀ / мл) и Changchun099 (10 ^5,0 до 10 ^2,0 CCID ₅₀ / мл) с модифицированной средой Игла (MEM) в качестве отрицательного контроля для каждой группы вирусов.

У мышей, инфицированных Changchun046 с титрами 10 ^5,0 –10 ^4,0 CCID ₅₀ / мл, начали проявляться симптомы 1 степени (см. Ниже) на 3 день постинфекции. Симптомы постепенно становились более серьезными, пока не достигли 5-й степени на 6-й и 9-й дни соответственно (рис. 2А). Титры 10 ^5,0 и 10 ^4,0 CCID ₅₀ / мл Changchun046 вызвали смерть на 3-й и 4-й дни со 100% -ной смертностью на 9-й и 10-й дни постинфекции (рис. 2А).Лог-ранговые тесты показали, что выживаемость мышей, получавших 10 ^5,0 и 10 ^4,0 CCID ₅₀ / мл Changchun046 / мл, статистически отличалась от показателей для контрольной группы ( P <0,001). Changchun046 при более низких титрах от 10 ^3,0 до 10 ^2,0 CCID ₅₀ / мл вызывал 50 и 28,6% смертности, соответственно (рис. 2A). Как и ожидалось, контрольная группа не испытала смертности или симптомов в течение 21-дневного периода (рис.2А).

Вирусы CV-A6-Changchun вызывают клинические симптомы и смертность в зависимости от дозы. Однодневным мышам ICR ( n = от 8 до 10 на помет) интрацеребрально инокулировали 10-кратно серийно разведенные дозы вирусов (10 мкл / мышь). Контрольных животных ложно инфицировали MEM вместо вируса (10 мкл / мышь). Клинические симптомы и смертность отслеживались ежедневно в течение 21 дня после инфицирования. Новорожденных мышей заражали 10 ^2,0 -10 ^5,0 CCID ₅₀ / мл вируса Changchun046 (A), 10 ^1.0 до 10 ^4,0 CCID ₅₀ / мл вируса Changchun097 (B), 10 ^2,0 до 10 ^5,0 CCID ₅₀ / мл вируса Changchun099 (C) или 10 ^3,0 до 10 ^6.0 CCID ₅₀ / мл вируса Changchun098 (D). Лог-ранговый тест использовали для сравнения выживаемости новорожденных мышей между группами и контрольной группой через 21 день после заражения. ***, P <0,001; *, P <0,05. Показан один представитель трех независимых тестов.

Для Changchun097 зараженные мыши начали болеть на 2-й день с титрами 10 ^4,0 –10 ^3,0 CCID ₅₀ / мл, и все мыши в этих группах быстро достигли симптомов 5 степени до 6-го дня постинфекции. (Рис. 2B). Сто процентов мышей, которым инъецировали Changchun097 с титрами 10 ^4,0 –10 ^3,0 CCID ₅₀ / мл, погибли на 2 и 3 дни после инокуляции (фиг. 2B). Удивительно, но даже при относительно низких титрах 10 ^2.0 –10 ^1,0 CCID ₅₀ / мл, Changchun097 приводил к смертности мышей 78,6 и 33,3% соответственно. Кроме того, тесты логарифмического ранга показали, что выживаемость новорожденных мышей, получавших 10 ^4,0 –10 ^2,0 CCID ₅₀ / мл Changchun097, значительно отличалась от показателей в контрольной группе ( P <0,001) . Никаких клинических симптомов или летальных исходов в группе отрицательного контроля не наблюдалось (рис. 2В).

Мыши, инфицированные разными титрами Changchun099, начали болеть на 3-5 день после заражения (рис.2С, сорт 2). После увеличения клинической степени симптомов группы 10 ^5,0 -, 10 ^4,0 — и 10 ^3,0 -CCID ₅₀ / мл достигли симптомов 5 степени на 6, 7 и 11 дни соответственно. Сто процентов инфицированных мышей умерли на 7, 8 и 11 дни при титрах 10 ^5,0 –10 ^3,0 CCID ₅₀ / мл, тогда как вирус вызвал 76,5% смертности при титре 10 ^2,0 CCID ₅₀ / мл. Показатели выживаемости во всех четырех группах, получавших Changchun099, значительно отличались от таковых в контрольной группе ( P <0.001). В контрольной группе не было никаких летальных исходов или клинических симптомов (рис. 2С).

Зараженные мыши, которым вводили 10 ^6,0 , 10 ^5,0 , 10 ^4,0 и 10 ^3,0 CCID ₅₀ / мл Changchun098, начали болеть на 4, 5, 5 и 5 дни соответственно. В этих группах выживаемость составила 43,8, 90, 92,3 и 93,8%, соответственно, со средним клиническим баллом 3 степени (рис. 2D). Однако только мыши, получавшие 10 ^6,0 CCID ₅₀ / мл Changchun098, отличались от контрольной группы ( P <0.05), согласно результатам ранжирования журнала.

Вышеупомянутые результаты позволяют предположить, что штаммы CV-A6-Changchun можно разделить на летальные (Changchun046, Changchun097 и Changchun099) и нелетальные штаммы (Changchun098), и измеренная LD ₅₀ s Changchun046, Changchun097 и Changchun099 составляли 2,00 × 10 ¹ , 3,16 × 10 ⁰ и 5,01 × 10 ⁰ CCID ₅₀ / мышь соответственно.

Патологический анализ штаммов CV-A6-Changchun у новорожденных мышей.Чтобы понять патогенез штаммов CV-A6-Changchun, которые могут быть связаны со смертью новорожденных мышей, мы провели серию патологических анализов девяти тканей. Инфицированные мыши, которым вводили 10 ^5,0 –10 ^4,0 CCID ₅₀ / мл Changchun046, Changchun097, Changchun098 и Changchun099 и имели клинические баллы 4 или 5 степени, собирали для патологического анализа. Мышцы задних конечностей и мышечные волокна позвоночника демонстрировали тяжелый некроз, включая перелом мышечного пучка (черные стрелки), набухание мышечных волокон (зеленые стрелки), растворение ядер (красные стрелки) и сжатие (синие стрелки) в Чанчунь046-, Чанчунь097- и Чанчунь099 -инфицированные мыши (рис.3B, C, D, G, H и I) по сравнению с мышами отрицательного контроля (рис. 3A и F). Однако не было обнаружено никаких явных изменений в мышцах задних конечностей и мышечных волокнах позвоночника у мышей, инфицированных Changchun098 (рис. 3E и J). Более того, не наблюдалось никаких обнаруживаемых патологических изменений в сердце (фиг. 3L-O), легких (фиг. 3Q-T) или кишечнике (фиг. 3V-Y). Никаких очевидных патологических симптомов не было обнаружено в тканях мозга, печени, селезенки или почек у мышей, инфицированных CV-A6-Changchun (данные не показаны).Эти результаты показывают, что три летальных циркулирующих штамма CV-A6-Changchun обладают сильным тропизмом к мышечным тканям, тогда как Changchun098 является исключением. Эти данные соответствуют результатам летальных экспериментов на неонатальных мышах (рис. 2).

Патологический анализ новорожденных мышей, инфицированных CV-A6. Однодневным мышам ICR интрацеребрально вводили Changchun046 (10 ^5,0 CCID ₅₀ / мл), Changchun097 (10 ^4,0 CCID ₅₀ / мл), Changchun099 (10 ^5.0 CCID ₅₀ / мл) или Changchun098 (10 ^5,0 CCID ₅₀ / мл) или среду (отрицательный контроль). Инфицированных мышей 4 или 5 степени, у которых обнаружен тяжелый паралич задних конечностей, вскрывали для окрашивания H&E. Показаны репрезентативные изображения мышц задней конечности, мышцы позвоночника, сердечной мышцы, а также тканей легких и кишечника после инфицирования. Волокна мышц задних конечностей (от B до D) и мышц позвоночника (от G до I) показали тяжелый некроз, включая перелом мышечного пучка (черные стрелки), набухание мышечных волокон (зеленые стрелки), ядерное растворение (красные стрелки) и усыхание (синие стрелки). ), у мышей, инфицированных Changchun046-, Changchun097- и Changchun099.Не было обнаружено явных изменений в мышцах задних конечностей и мышечных волокнах позвоночника у мышей, инфицированных Changchun098 (E и J), и не было обнаружено патологических изменений в сердце (L к O), легких (Q к T) или кишечнике. (От V до Y). Увеличение, × 400 (шкала 20 мкм). Результаты представляют три независимых эксперимента.

Вирусные нагрузки в различных тканях новорожденных мышей, инфицированных CV-A6-Changchun. Для дальнейшего изучения репликации и распределения штаммов CV-A6 у инфицированных мышей мы измерили вирусные нагрузки в 10 образцах в разные моменты времени после инокуляции.Вирусные нагрузки измеряли на 2, 4 и 6 дни во всех образцах мышей, инфицированных каждым из четырех штаммов CV-A6-Changchun. Как показано на фиг. 4, вирусы были обнаружены почти во всех тканях при относительно низком числе копий для всех штаммов CV-A6-Changchun на 2-й день постинокуляции. На 4-й день постинфекции вирусная нагрузка в мышцах позвоночника, мышцах задних конечностей и крови неуклонно увеличивалась, при этом количество копий достигло 10 ^8,98 копий / мг, 10 ^8,69 копий / мг и 10 ^7,90 копий / мл. соответственно для Changchun046; 10 ^8.08 копий / мг, 10 ^8,15 копий / мг и 10 ^5,15 копий / мл соответственно для Changchun097; и 10 ^7,93 копий / мг, 10 ^7,45 копий / мг и 10 ^6,60 копий / мл соответственно для Changchun099. Однако вирусная нагрузка у мышей, инфицированных Changchun098, составляла всего 10 ^4,29 копий / мг, 10 ^4,52 копий / мг и 10 ^5,43 копий / мл в соответствующих тканях на 4-й день. Эти результаты позволяют предположить, что вирус распространялся системно и неуклонно увеличивался на 4-й день после инфицирования.

Кинетика уровней вирусной нагрузки в различных тканях мышей, инфицированных CV-A6, в разные моменты времени. Однодневным мышам ICR интрацеребрально инокулировали Changchun046 (10 ^5.0 CCID ₅₀ / мл) (A), Changchun097 (10 ^4.0 CCID ₅₀ / мл) (B), Changchun099 (10 ^5.0 CCID ₅₀ / мл) (C) и Changchun098 (10 ^5.0 CCID ₅₀ / мл) (D). Вирусные нагрузки определяли с помощью qRT-PCR на 2, 4 и 6 дни после инфицирования в 10 образцах.Результаты представляют собой среднюю вирусную нагрузку (log ₁₀ копий на миллиграмм ткани или log ₁₀ копий на миллилитр крови) ± стандартное отклонение (3 мыши / группа; повторяется 3 раза). Представленные данные являются репрезентативными для результатов трех независимых экспериментов.

Через шесть дней после инокуляции вирусы были обнаружены в мышцах позвоночника, мышцах задних конечностей и крови на относительно высоких уровнях для Changchun046 (рис. 4A) (10 ^8,25 копий / мг, 10 ^9,19 копий / мг, и 10 ^7.27 копий / мл соответственно), Changchun097 (рис. 4B) (10 ^8,44 копий / мг, 10 ^7,81 копий / мг и 10 ^7,25 копий / мл соответственно) и Changchun099 (рис. 4C ) (10 ^7,68 копий / мг, 10 ^6,92 копий / мг и 10 ^4,87 копий / мл соответственно). Changchun098 (рис. 4D) (10 ^5,23 копий / мг, 10 ^4,46 копий / мг и 10 ^4,33 копий / мл, соответственно) имел относительно низкие вирусные нагрузки в трех тканях.Эти результаты показали, что на 6-й день вирусная нагрузка летальных штаммов была на 2,4-3,2 логарифмических единиц выше в мышцах позвоночника, на 2,5-4,7 логарифмических единиц выше в мышцах задних конечностей и на 0,5-2,9 логарифмических единиц выше в крови, чем таковые из несмертельного штамма Changchun098. У мышей отрицательного контроля не было обнаружено вирусной нагрузки ни в одном из 10 отобранных образцов, что указывает на специфичность наших результатов. Вышеупомянутые результаты также предполагают, что CV-A6 обладает сильным тропизмом к мышечным тканям, которые могут быть основным местом для вирусной дупликации.Changchun098 немного отличался от Changchun046, Changchun097 и Changchun099 по вирусной репликации и распространению. Эти результаты также соответствовали показателям выживаемости и клиническим показателям у смертельно инфицированных новорожденных мышей (рис. 2) и патологическим изменениям (рис. 3) после заражения.

Одноступенчатая кривая роста CV-A6 в клетках RD. Чтобы определить, является ли летальность штаммов Changchun CV-A6 из-за их активности в репликации вируса, был проведен одноэтапный анализ роста с 2-часовым интервалом. .Changchun046, как самый слабый штамм в летальной группе, и Changchun098, как единственный несмертельный штамм в этом исследовании, были протестированы на клетках RD. Как показано на фиг.5, уровни обоих вирусов, определенные с помощью CV-A6-специфической количественной обратной транскрипции (qRT) -PCR в реальном времени (данные не показаны), сначала увеличивались в культуральной среде, что указывает на репликацию и высвобождение вируса. за которым затем последовало снижение, скорее всего, из-за адсорбции вируса на RD-клетках, чтобы начать следующий раунд заражения.Однако даже при аналогичных вирусных дозах для инициации инфекции уровни летального штамма Changchun046 были постоянно выше, чем уровни несмертельного штамма Changchun098 во время фазы репликации / высвобождения и показали первый пик высвобождения вируса через 14 часов после адсорбции, который составил 2 ч раньше, чем обнаружено с помощью Changchun098. Кроме того, в пиковые периоды было обнаружено больше вирусов Changchun046, чем Changchun098. Эти результаты продемонстрировали, что вирусная репликация и высвобождение летального штамма CV-A6 были намного более мощными, чем репликация нелетального штамма CV-A6, и этот результат коррелировал с летальностью ассоциированных штаммов CV-A6 на мышиной модели (сравните Инжир.С 5 по 2).

Летальность CV-A6 коррелирует с репликацией и высвобождением вируса. Показаны одноэтапные кривые роста CV-A6 Changchun046 и Changchun098. Аналогичные количества вирусов Changchun046 и Changchun098, основанные на количественной оценке генома с помощью qRT-PCR, были использованы для заражения клеток RD. После адсорбции вируса в течение 6 часов инфицированные клетки промывали, среду заменяли поддерживающей средой и определяли уровни высвобожденных вирусов в среде с помощью qRT-PCR с 2-часовыми интервалами, начиная с 8-часовой постадсорбции.Значения показаны как средние ± стандартное отклонение.

Штаммы CV-A6-Changchun являются продуктами рекомбинации между Gdula и CV-A4. Чтобы выявить возможные причины разной патогенности, наблюдаемой среди штаммов CV-A6-Changchun, мы сначала проверили, имеют ли летальные и нелетальные штаммы разные модели рекомбинации. Были проведены тесты на сходство на основе полного генома с использованием прототипных штаммов членов группы HEV-A в качестве контрольных последовательностей и каждого из четырех полноразмерных штаммов CV-A6-Changchun в качестве запроса.EV-D68 и полиовирус 1 использовались как выбросы. К нашему удивлению, несмотря на разную эффективность в патогенезе, все четыре штамма CV-A6-Changchun продемонстрировали сходные модели рекомбинации, которые в основном были основаны на прототипах CV-A6 и CV-A4 (рис. 6A – D). Рекомбинация была дополнительно подтверждена анализом бутсканирования во всю длину (рис. 6E-H). В обоих тестах области P1 всех четырех штаммов CV-A6-Changchun были филогенетически связаны с таковыми у прототипа Gdula (рис. 6).Кроме того, CV-A4 был близок к штаммам CV-A6-Changchun в областях P2 / P3 (рис. 6). Паттерны рекомбинации всех штаммов CV-A6-Changchun были почти идентичны по всему геному, причем область 2C (позиции 4105-5091) Changchun098 была ближе к таковой у штамма Gdula, чем у трех других штаммов CV-A6-Changchun в оба теста (рис. 6). Действительно, несколько предыдущих исследований показали, что современные штаммы CV-A6 являются продуктами рекомбинации между Gdula и другими циркулирующими энтеровирусами, такими как CV-A4 (16, 17).Современные штаммы CV-A6-Changchun, скорее всего, являются рекомбинантами между Gdula и прототипом CV-A4 или неизвестным родительским вирусом, подобным CV-A4.

Тесты на сходство и анализ загрузочного сканирования штаммов CV-A6-Changchun и прототипов Gdula и CV-A4 на основе полноразмерных геномов. Тесты на подобие Changchun046 (A), Changchun097 (C), Changchun099 (E) и Changchun098 (G) были выполнены с прототипными штаммами членов группы HEV-A. Результаты испытаний показали, что современные штаммы CV-A6, циркулирующие в Чанчуне, в основном являются рекомбинантами между CV-A6 и CV-A4, как описано ранее (16, 17).Таким образом, для лучшей демонстрации только CV-A4 (инвентарный номер AY421762) и CV-A6 Gdula (инвентарный номер AY421764) были включены в качестве эталонных последовательностей для тестов загрузочного сканирования для Changchun046 (B), Changchun097 (D), Changchun099 (F). , и Changchun098 (H). EV-D68 (инвентарный номер AY426531) и полиовирус 1 (инвентарный номер V01150) использовались как выбросы как в тестах на сходство, так и в анализах загрузочного сканирования. Все тесты проводились с полноразмерными вирусными геномами. Вверху показан рисунок генома энтеровирусов.

Филогенетический анализ штаммов CV-A6-Changchun с другими штаммами CV-A6 из Китая и других стран. Для дальнейшего изучения причины летальности CV-A6 четыре штамма Changchun CV-A6 были подвергнуты филогенетическому анализу на основе различных фрагментов. (то есть 5 ‘UTR, P1, P2 и P3). Чтобы расширить поиск, мы включили 34 дополнительных последовательности CV-A6, выделенных из других провинций Китая и других регионов мира. Прототип последовательности CV-A6 Gdula использовался в качестве внешней группы.

Все филогенетические анализы показали, что штамм Changchun098 был тесно связан со штаммами PF3 / SH / CHN / 2013, 5056 / SH / CHN / 2013, 5039 / SH / CHN / 2013 и PF1 / SH / CHN / 2013 (рис. 7A – D), которые все были изолированы от Шанхая, Китай. Дерево NJ для последовательностей P2 наиболее тесно коррелировало с летальностью штаммов Changchun CV-A6. Несмертельный Changchun098 находился в отдельном кластере от летальных Changchun046, Changchun097 и Changchun099 (рис. 7C). Подобная кластеризация не наблюдалась для других фрагментов, таких как 5 ‘UTR (рис.7A), P1 (фиг. 7B) и P3 (фиг. 7D). Этот образец соответствовал вкладу P2 в летальность штаммов CV-A6-Changchun.

Филогенетические деревья, построенные для областей 5 ‘UTR, P1, P2 и P3 штаммов CV-A6-Changchun с другими штаммами CV-A6, полученными из базы данных GenBank. Были созданы деревья соединения соседей на основе полноразмерных областей 5 ‘UTR (A), P1 (B), P2 (C) и P3 (D). Все деревья были протестированы методом начальной загрузки для 1000 реплик, и в узлах показаны значения> 70.●, изоляты CV-A6-Changchun.

Вирусный белок 2C вносит вклад в патогенность CV-A6. Чтобы идентифицировать остатки, потенциально ответственные за летальность вируса, выравнивание последовательности белка было выполнено в области P2 CV-A6. В результате различия между летальными и нелетальными группами были обнаружены в восьми позициях (129, 262, 267, 290, 297, 324, 339 и 556), причем три из них (324, 339 и 556) были объединены в каждой группе (рис. 8). Все эти три положения были расположены в области 2C CV-A6, что указывает на то, что белок 2C может быть ответственным за летальность CV-A6.

Выравнивание последовательностей летальных и нелетальных штаммов CV-A6. Аминокислотные последовательности областей P2 штаммов CV-A6 из Чанчуня и других мест в Китае и во всем мире были выровнены, и указаны конкретные положения, возможно связанные с летальностью, на основе различий между летальной группой (содержащей Changchun046, Changchun097 и Changchun099) и нелетальная группа (содержащая Changchun098). Прочерки обозначают аминокислотные остатки, идентичные аминокислотным остаткам Changchun098.

Чтобы еще раз подтвердить, что 2C вносит вклад в патогенность CV-A6, мы ввели еще две последовательности белка 2C из штаммов CV-A6 с зарегистрированной летальностью. Weifang / SD / CHN / 2014 / был эффективен в уничтожении 5-дневных мышей (29) и разделял аминокислоты в положениях 324, 339 и 556 с летальными линиями (рис. 8). TW / 2007/00141 имел LD ₅₀ 1,33 × 10 ³ CCID ₅₀ / мышь (т.е. менее летальный, чем Changchun046) (30) и имел 2 остатка (в положениях 324 и 339), идентичные таковым из летальных штаммов, но 1 остаток (позиция 556) был идентичен таковому у нелетальных штаммов (рис.8). Эта информация подтвердила идею о том, что эти 3 аминокислоты способствуют патогенности белка 2C и CV-A6.

Белок CV-A6 2C способствует гибели клеток, вызывая аутофагию. Чтобы определить вклад вирусного белка 2C в патогенность CV-A6, мы трансфицировали векторы, экспрессирующие Changchun046 2C-, Changchun097 2C- и Changchun098 2C, в клетки RD. и проверяли выживаемость клеток через 48 часов после трансфекции. Changchun099 2C был исключен, потому что части его аминокислотной последовательности были идентичны таковой Changchun097 2C.В результате экзогенная экспрессия белков Changchun046 2C, Changchun097 2C и Changchun098 2C привела к 47,57, 68,89 и 27,38% летальности, соответственно, в трансфицированных клетках RD, которые все значительно отличались от таковой в контрольной группе ( P <0,001) (рис. 9A). Наблюдаемые уровни гибели клеток из-за экзогенной экспрессии белков 2C коррелировали с летальностью ассоциированных штаммов CV-A6 в модели мышей (сравните фиг. 9A с фиг. 2).

Белок CV-A6 2C индуцирует гибель клеток посредством аутофагии вместо апоптоза в клетках RD.(A) Летальность клеток, вызванная различными белками CV-A6 2C в клетках RD. Векторы, экспрессирующие Changchun046 2C-, Changchun097 2C- или Changchun098 2C-, трансфицировали в клетки RD, и через 48 часов после трансфекции проводили анализ клеточной пролиферации. Показаны результаты вестерн-блоттинга, указывающие на уровни экспрессии вирусных белков 2C для эксперимента по летальности клеток. (B) Типичные блок-схемы для анализа апоптоза. Векторы, экспрессирующие Changchun046 2C-, Changchun097 2C- или Changchun098 2C, трансфицировали в клетки RD.Клетки RD собирали через 48 часов после трансфекции, и гибель клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. Указаны проценты апоптотических клеток, соответствующие повышенной интенсивности флуоресценции FITC для каждого из экспериментальных условий. Клетки RD, трансфицированные VR1012 или обработанные STS, использовали в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно. (C) Гистограмма анализа апоптоза в клетках RD. Показаны результаты вестерн-блоттинга, указывающие на уровни экспрессии вирусных белков 2C из панели B.(D) Визуализация живых клеток, показывающая агрегацию GFP-LC3. Клетки RD котрансфицировали pEGFP-LC3 и пустым вектором VR1012, Changchun046 2C, Changchun097 2C или Changchun099 2C. Рапамицин использовали в качестве положительного контроля для индукции аутофагии. Агрегации GFP-LC3 в клетках наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии через 48 часов после трансфекции. Показаны репрезентативные изображения. Увеличение, × 400. (E) Гистограмма, показывающая среднее образование точек GFP-LC3 в клетках RD, экспрессирующих CV-A6 2C. Каждое значение столбца указывает среднее количество точек GFP в 10 ячейках на образец.Рапамицин использовали в качестве положительного контроля. (F) Результаты вестерн-блоттинга, показывающие экспрессию белка 2С в клетках RD из панели E. Значения на панелях A, C и E показаны как средние ± стандартное отклонение.

Апоптоз обычно наблюдается при гибели клеток, вызванной энтеровирусом (31–33). Чтобы определить, вызвана ли CV-A6 2C-опосредованная гибель клеток 2C-индуцированным апоптозом, клетки RD трансфицировали векторами, экспрессирующими экзогенные белки 2C или контрольный вектор VR1012, или обрабатывали стауроспорином (STS) в конечной концентрации 4 нМ. и протестирован на положительный аннексин V.Результаты показали, что STS индуцировал апоптоз со скоростью 6,42%, что было намного выше, чем обнаруженный в клетках, трансфицированных VR1012 (фиг. 9B и C). С другой стороны, в клетках, экспрессирующих производные летального штамма Changchun046 2C или Changchun097 2C или производные летального штамма Changchun098 2C, или производные летального штамма Changchun098 2C, апоптоз не наблюдался по сравнению с клетками, трансфицированными VR1012 (фиг. 9B и C). Эти результаты показали, что белок CV-A6 2C не может индуцировать апоптотическую гибель клеток RD.

Предыдущее исследование показало, что CV-A16 2C индуцировал аутофагию в клетках HeLa, блокируя слияние аутофагосом с лизосомами и запуская накопление аутофагосом, о чем свидетельствует образование точек, помеченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), связанного с микротрубочками белка 1. цепь 3 (LC3) (34).Таким образом, белок CV-A6 2C может также вызывать гибель RD-клеток посредством аутофагии. Для подтверждения этой гипотезы векторы, экспрессирующие GFP-LC3 и CV-A6 2C, котрансфицировали в клетки RD, и образование точек GFP-LC3 определяли с помощью флуоресцентной микроскопии через 48 часов после трансфекции. Рапамицин (также известный как сиролимус; Selleck Chemicals, Хьюстон, Техас, США) был включен в качестве положительного контроля для запуска аутофагии (31). Как показано на фиг. 9D и E, добавление рапамицина, но не его диметилсульфоксида (ДМСО) в качестве растворителя, увеличивало образование точек GFP-LC3, подтверждая достоверность анализа.Сравнивая клетки, трансфицированные контрольным вектором, клетки RD, экспрессирующие CV-A6 2C, показали большее количество точек GFP-LC3 (фиг. 9D), что указывает на то, что аутофагия вносит вклад в цитотоксичность, индуцированную CV-A6 2C. При сходных уровнях экспрессии (фиг. 9F) производные от летального штамма Changchun046 2C и Changchun097 2C индуцировали большее образование точек GFP-LC3, чем полученные из нелетального штамма Changchun098 2C (фиг. 9D и E). Взятые вместе, наши результаты показали, что CV-A6 2C запускает гибель клеток через аутофагию, внося свой вклад в патогенез штаммов CV-A6.

ОБСУЖДЕНИЕ

Рекомбинация — общая черта энтеровирусов, особенно тех, которые связаны с HFMD. В последнее время во многих исследованиях сообщалось, что несколько вирусов группы HEV-A, особенно инфекции, не относящиеся к EV-A71 и не-CV-A16, могут коинфектировать человека, коциркулировать в одном и том же географическом районе и давать вирусам возможность подвергнуться рекомбинации ( 16, 20, 29). Наши предыдущие исследования также показали, что циркулирующие CV-A16 и EV-A71 были рекомбинантами на основе своих прототипов вирусов (7–9).В настоящем исследовании мы выделили и полностью секвенировали четыре штамма CV-A6, которые циркулировали в городе Чанчунь на северо-востоке Китая. Хотя филогения предполагала, что эти четыре современных штамма CV-A6 были тесно связаны с прототипом Gdula, на самом деле они были рекомбинантами между Gdula (в основном в области P1) и CV-A4 (в основном в областях P2 / P3). Сходный паттерн рекомбинации также был обнаружен у штаммов CV-A6, выделенных в Шанхае в 2013 году, которые имели более высокое сходство с недавним штаммом CV-A4, чем с недавним штаммом CV-A6 в областях 2C и 3′-UTR, а также рекомбинантным штаммом. Штамм CV-A6 приводил к более генерализованной сыпи, чем нерекомбинантный штамм CV-A6 (16, 35).Эти данные свидетельствуют о том, что коциркуляция штаммов CV-A4 и CV-A6 в одном и том же географическом регионе была относительно обычным явлением в Китае (20, 36), и это увеличило бы возникновение рекомбинации между двумя серотипами. Однако штаммы CV-A6, выделенные из Вэньчжоу (15), демонстрировали три различных паттерна точек разрыва рекомбинации, причем таковые у большинства штаммов располагались на 3′-концах областей 5′-UTR и 2A, тогда как некоторые штаммы демонстрировали тесную взаимосвязь с CV-A2. и штаммы CV-A8 и другие были локализованы в области P3.Gaunt et al. (17) проанализировали штаммы CV-A6, выделенные из Эдинбурга, Шотландия, в 2008 и 2014 годах, и восемь рекомбинантных форм (RF-AH) циркулировали во всем мире за последние 10 лет, причем контрольные точки рекомбинации расположены в регионах 2A-2C и VP3. и между областями 5′-UTR и VP1. Совсем недавно сообщалось, что недавние группы рекомбинации CV-A6 (RF-E, -F, -H, -J и -K) имели общего предка (RF-A), и контрольные точки рекомбинации были расположены между 2A-2C и 5′-UTR области (37).События рекомбинации могут играть значительную роль в эволюции геномов энтеровирусов, и точки останова, обнаруженные в этих исследованиях (области 2A-2C), являются хорошо известными горячими точками рекомбинации (38). Эти результаты вместе с нашими выводами показали, что неструктурные области могут потенциально вносить вклад в клинические фенотипы и исходы инфекции CV-A6.

События рекомбинации могут дать вирусу преимущества, такие как уклонение хозяина от иммунитета или усиление инфекции. Другой особенностью энтеровирусов является то, что передачу вирусов-прототипов трудно обнаружить.Фактически, нам ничего не известно о каких-либо недавних обнаружениях прототипа CV-A6 Gdula или прототипа CV-A16 G-10; Сообщалось лишь о нескольких случаях прототипа BrCr EV-A71 (39). Наиболее правдоподобное объяснение потери следа прототипических энтеровирусов состоит в том, что рекомбинация очень полезна для вирусной инфекции и репликации, позволяя вирусам превосходить свои прототипы, чья инфекционность ниже.

Район P1 современных энтеровирусов консервативен по отношению к его гомологам в штаммах-прототипах.Другими словами, интертипная рекомбинация не может быть обнаружена в области P1, кодирующей все структурные белки (VP1, VP2, VP3 и VP4). Наши результаты загрузочного сканирования также показали, что события рекомбинации между Gdula и CV-A4 произошли в областях 5′-UTR и 2A, но не в пределах P1. Наше недавнее исследование EV-D68 показало, что аминокислотная замена только на VP1 влияла на вирусную инфекционность и способствовала вспышке EV-D68 в Северной Америке в 2014 г. (40). Такие события, как рекомбинация, могут привести к драматическим изменениям в структурных белках энтеровирусов, что может привести к сбою сборки вируса или бессилию при инфекции хозяина.

Четыре штамма CV-A6-Changchun проявили различную летальную активность у мышей. Различия не были обусловлены предпочтениями штамма к инфицированию различных тканей или силой репликации вируса in vivo . Филогенетический анализ области P2 разделил штаммы CV-A6 на летальные и нелетальные группы. Кроме того, мы идентифицировали три уникальные аминокислоты в области 2C, которые были идентичны в каждой группе. Белок 2C является наиболее консервативным белком вирусов Picornaviridae.Сообщалось, что N-концевой белок полиовируса 2C обладает АТФазной и слабой ГТФазной активностью (41, 42). Белок 2C EV-A71 играет важную роль в репликации вируса (42–44), ингибируя активацию энхансера легкой цепи каппа ядерного фактора активированных В-клеток (NF-κB) пути (45). В настоящем исследовании мы также наблюдали, что только 2C из CV-A6 вызывает гибель клеток через аутофагию вместо апоптоза, и мы связали эту способность с 3 остатками (рис. 8 и 9). Кроме того, данные нескольких исследований, в том числе настоящего, показали тесную взаимосвязь между вариациями вирусного белка 2C и летальностью CV-A6, по крайней мере, в модели на мышах (29, 30).Белок 2C может принести пользу CV-A6, вызывая гибель клеток и способствуя высвобождению потомства вириона, что сокращает цикл заражения вирусом (рис. 5). Наши наблюдения за аутофагией, индуцированной 2C, и ее связь с вирусной летальностью подтверждают, что 2C является потенциальной мишенью для разработки лекарств против CV-A6.

В заключение, мы получили четыре репрезентативных штамма CV-A6-Changchun из 39 CV-A6-положительных образцов, и первичный филогенетический анализ показал, что несколько штаммов из Шанхая внесли наибольший вклад в CV-A6, циркулирующий в Чанчуне.Результаты испытаний на животных показали, что штаммы Changchun046, Changchun097 и Changchun099 были летальными, тогда как штамм Changchun098 не был смертельным. Тесты на сходство и загрузочное сканирование показали, что все четыре штамма CV-A6-Changchun были рекомбинантами Gdula и прототипа CV-A4 или неизвестного родительского вируса, похожего на CV-A4. Эти тесты не смогли выявить потенциальную причину явной летальности. Летальность этих штаммов, определенная in vivo, коррелировала с их эффективностью при репликации вируса и высвобождением in vitro .Кроме того, изменения аминокислот между летальной и нелетальной группами были обнаружены в нескольких положениях; три замены в области 2C были идентичными в каждой группе и были связаны со способностью вызывать аутофагию, а также с патогенностью белка. Настоящий отчет обогащает эпидемиологическую информацию о CV-A6 на северо-востоке Китая, подтверждая модель рекомбинации Gdula / CV-A4 современного CV-A6 и выявляя различную летальность среди штаммов CV-A6, в которой может участвовать вирусный белок 2C.Вирусный белок 2C может быть хорошей мишенью для разработки противовирусных препаратов против инфекции CV-A6.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Заявление об этике и выбор образцов. Комитет по этике Первой больницы Цзилиньского университета одобрил это исследование, и процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами. Информированное согласие было получено от родителей или опекунов испытуемых. Из 101 образца стула, предоставленного Центром контроля и профилактики заболеваний (CDC) провинции Цзилинь в 2013 году и использованного для этого исследования, 39 были определены как положительные на CV-A6 с помощью набора для флуоресцентной ПЦР (Guangzhou Huayin Medical Technology Inc., Гуандун, Китай). Частичные последовательности VP1 были извлечены и проанализированы филогенетически. Четыре репрезентативных штамма Changchun CV-A6 были отобраны для выделения ДНК, полного секвенирования генома и дальнейших анализов.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), ПЦР-амплификация и секвенирование. Экстракцию общей РНК из образцов стула проводили с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. КДНК получали в реакционном объеме 20 мкл с использованием 1 пМ каждого праймера кДНК (46) (праймеры AN32, AN33, AN34 и AN35 [таблица 1]) и EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech, Beijing, Китай) согласно предоставленным инструкциям.ПЦР проводили в объемах 100 мкл, содержащих 10 мкл кДНК, 2,5 ед. ДНК-полимеразы PrimeStar HS (TaKaRa, Далянь, Китай), 2 мкл специфических прямых и обратных праймеров (по 10 мкМ каждый), 8 мкл дезоксинуклеотида (dNTP). смеси (по 2,5 мМ каждый) и 10 мкл 5 × буфера PrimeStar (плюс MgCl ₂ ). Параметры ПЦР для всех реакций были следующими. кДНК денатурировали при 94 ° C в течение 4 мин. Амплификацию выполняли в течение 35 циклов, состоящих из стадии денатурирования в течение 30 с при 94 ° C, стадии отжига праймера в течение 30 с при 49-60 ° C и стадии элонгации из двух частей в течение 1-2 мин при 72 ° C. ° C.Удлинение проводили при 72 ° C в течение 10 мин. Реакции анализировали электрофорезом в 1,0% агарозном геле. Праймеры, используемые для амплификации и детекции CV-A6, перечислены в таблице 1. Расположение праймеров было обозначено в соответствии с прототипом штамма Gdula CV-A6 (номер доступа GenBank AY421764). Все ампликоны секвенировали двунаправленно.

Праймеры для обратной транскрипции, ПЦР и секвенирования, использованные в этом исследовании

Филогенетические анализы. Для определения филогенетической взаимосвязи между штаммами Changchun CV-A6 и штаммами из других мест, последовательности CV-A6, включая прототип Gdula, были выровнены. с помощью программного комплекса MEGA (версия 5.0,5) (47). Впоследствии эти выравнивания были скорректированы вручную. Прототипы из группы HEV-A были включены в качестве контрольных последовательностей, тогда как EV-D68 Fermon и полиовирус Sabin 1 использовались в качестве внешней группы (таблица 2). Деревья штата Нью-Джерси были построены с использованием 2-параметрической модели Кимуры и 1000 повторений начальной загрузки. Значения начальной загрузки более 70% считались статистически значимыми для группировки. Использовали последовательности различной длины и ссылочные последовательности, как указано в подписях к фигурам.

Эталонные штаммы, использованные в этом исследовании

Клетки, антитела и штаммы вирусов.RD клетки рабдомиосаркомы человека (№ CCL-136) были получены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США). Их выращивали в MEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 3% l-глутамина при 37 ° C и 5% CO ₂ . Репрезентативные штаммы Changchun046, Changchun097, Changchun098 и Changchun099 были собраны, когда цитопатогенный эффект (ЦПЭ) достиг 90%. Вирусные титры определяли в клетках RD методом CPE на микропланшете и рассчитывали с помощью метода Рида-Мюнха (48).

Для обнаружения экспрессии белка использовали следующие антитела: антитела против тубулина (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) и против гемагглютинина (HA) Covance (Принстон, штат Нью-Джерси, США). Оба антитела использовали в соответствии с протоколами производителей.

Тест на инфицирование новорожденных мышей. Управление лабораторных животных Университета Цзилинь одобрило наши процедуры по уходу за животными и экспериментам, и мы проводили эксперименты в соответствии с принятыми руководящими принципами. Однодневных неонатальных мышей без специфических патогенов (SPF) ICR (приобретенных в Центре экспериментальных животных, Колледж базовой медицины, Университет Цзилинь, Чанчунь, Цзилинь, Китай) использовали для создания животной модели вирусной инфекции.Новорожденных мышей случайным образом разделили на пять групп по три помета на группу ( n = от 8 до 10 мышей / помет) и инокулировали интрацеребрально вышеупомянутыми четырьмя штаммами CV-A6-Changchun или MEM (10 мкл / мышь. ). В течение 21 дня после инокуляции за всеми новорожденными мышами ежедневно наблюдали клинические симптомы и выживаемость. Симптомы оценивались следующим образом: 0 — здоровый; 1 — вялость и малоподвижность; 2, истощение; 3 — слабость при сотрясении конечностей; 4 — паралич задних конечностей; 5, умирающий или мертвый.Мыши контрольной группы были здоровы на протяжении всего эксперимента. LD ₅₀ рассчитывалась по методу Рида-Мюнха (48).

Гистопатологические анализы. Три мыши с симптомами 4 или 5 степени из каждой экспериментальной группы, Changchun046 (10 ^5,0 CCID ₅₀ / мл), Changchun097 (10 ^4,0 CCID ₅₀ / мл), Changchun098 ( 10 ^5,0 CCID ₅₀ / мл) и Changchun099 (10 ^5,0 CCID ₅₀ / мл) подвергали гистопатологическому анализу через 5 дней после заражения.Три здоровых мыши из контрольной группы также были включены в качестве отрицательного контроля. После анестезии мышей собирали девять типов тканей или органов (сердце, печень, селезенку, легкие, почки, кишечник, мозг, мышцы позвоночника и мышцы задних конечностей) и фиксировали погружением в 10% раствор формальдегида на 5 дней. Образцы обезвоживали в градиенте этанола, осветляли диметилбензолом и заливали парафином. Для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) были получены срезы ткани размером 4 мкм.Патогистологические анализы тканей проводились под световым микроскопом.

Вирусные нагрузки в тканях новорожденных инфицированных мышей. Для определения вирусной нагрузки использовали интрацеребрально Changchun046, Changchun097, Changchun098, Changchun099 или контрольную среду, по три зараженных мыши из каждой из вышеупомянутых групп и три мыши из отрицательного контроля. Все образцы (сердце, печень, селезенка, легкие, почки, кишечник, мозг, мышцы позвоночника, мышцы задних конечностей и кровь) собирали на 2, 4 и 6 дни после инфицирования.Все собранные образцы тканей взвешивали по отдельности и хранили при -80 ° C для дальнейшего анализа. Собранные образцы ткани разрушали, гомогенизировали в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) методом замораживания-оттаивания / измельчения, а затем центрифугировали. Супернатанты и кровь подвергали экстракции РНК, а вирусную нагрузку определяли с помощью qRT-PCR, как описано ранее (49). Вирусные нагрузки были выражены как log ₁₀ копий на миллиграмм ткани или log ₁₀ копий на миллилитр крови.

qRT-PCR. Для qRT-PCR были разработаны праймеры, специфичные для CV-A6, на основе консервативной области VP1 следующим образом: CV-A6-F, AATGAGGCGAGTGTGGAAC и CV-A6-R, AGGTTGGACACAAAAGTGAACT. КПЦР на основе SYBR green проводили на Mx3005P (Agilent Technologies Stratagene, Санта-Клара, Калифорния, США) с использованием TransStart Top Green qPCR Super Mix (Transgen Biotech). Каждая реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 10 мкл SYBR green Super Mix (2 ×), 0,5 мкл 10 мкМ (каждый) праймеров CV-A6-F и CV-A6-R, 7 мкл бидистиллированной H ₂ O и 2 мкл матрицы кДНК.Условия цикла были следующими: 50 ° C в течение 2 минут и 95 ° C в течение 10 минут, затем 45 циклов, состоящих из 95 ° C в течение 30 секунд и 60 ° C в течение 1 минуты. Число копий целевой кДНК в qRT-PCR определяли по стандартной кривой 10-кратных серийных разведений вектора, содержащего полноразмерный геном Changchun046 (от 10 ³ до 10 ⁹ копий). Абсолютное число копий РНК рассчитывали, используя стандартные кривые разведения плазмид, содержащих целевую последовательность.Чувствительность анализа или предел обнаружения определяли как наименьшее количество копий, которое постоянно амплифицировалось в пределах линейной части стандартной кривой.

Определение рекомбинации. Для определения возможных событий рекомбинации полноразмерные последовательности CV-A6-Changchun были сопоставлены с последовательностями штаммов-прототипов из группы HEV-A и подвергнуты тестам на сходство. Эталонные штаммы с высоким сходством (например, CV-A6 и CV-A4) были сохранены для анализов загрузочного сканирования с окном 500 п.н. и шагом 20.Оба теста были выполнены с использованием программного пакета SimPlot (версия 3.5.1) (50). EV-D68 Fermon и полиовирус Sabin 1 использовались в качестве внешней группы в обоих тестах.

Выравнивание последовательностей белков. Аминокислотные последовательности области P2 четырех штаммов CV-A6 и других 33 штаммов CV-A6 были выровнены с использованием программного пакета DNAMan (версия 6.0).

. Последовательность, кодирующая полноразмерный Changchun046 2C (номер доступа KT779410), была сконструирована с C-концевой меткой HA и вставлена ​​между сайтами SalI и BamHI VR1012 (30), в результате чего был получен рекомбинантный вектор VR1012. -Changchun046-2C-HA.VR1012-Changchun097-2C-HA и VR1012-Changchun098-2C-HA были сконструированы с использованием аналогичной стратегии на основе Changchun097 2C (номер доступа KT779411) и Changchun098 2C (номер доступа KT779412), соответственно, с использованием сайтов XbaI и BamHI VR1012. Начальный кодон и стоп-кодон были назначены каждой кодирующей области 2C во время ПЦР, чтобы помочь инициировать и прекратить трансляцию. Плазмида pEGFP-LC3 была сконструирована путем введения кодирующей рамки LC3 в вектор pEGFP-C1 (BD Biosciences Clontech, Mountain View, CA, USA) с сайтами XhoI и BamHI.Трансфекцию проводили с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ пролиферации клеток. Пролиферацию клеток оценивали с помощью набора для подсчета клеток TransDetect (CCK) (TransGen Biotech) в соответствии с протоколом производителя. Клетки RD высевали в 24-луночные планшеты (1 × 10 ⁵ клеток / лунку). Через 24 часа посеянные клетки трансфицировали VR1012-Changchun046-2C-HA, VR1012-Changchun097-2C-HA, VR1012-Changchun098-2C-HA и пустой плазмидой VR1012.Белок 2C из Changchun099 не был включен, поскольку он имел идентичные первичные аминокислотные последовательности с Changchun097. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и ресуспендировали в 600 мкл MEM. Каждый образец (100 мкл) повторно высевали в 96-луночный планшет, и в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента CCK. После инкубации при 37 ° C в течение еще 4 ч количество клеток на лунку измеряли по оптической плотности при 450 нм. Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Одноступенчатая кривая роста штаммов CV-A6 в клетках.Клетки RD высевали в 96-луночный планшет при плотности 3 × 10 ⁴ клеток на лунку за 1 день до анализа. Клетки инфицировали равным количеством летальных вирусов Changchun046 и нелетальных вирусов Changchun098 (количественно с помощью qRT-PCR). После 6 ч адсорбции вируса при 37 ° C супернатант удаляли, а клетки дважды тщательно промывали MEM для удаления несвязавшегося вируса. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл поддерживающей MEM, содержащей 1% FBS, и планшеты инкубировали при 37 ° C.Во время инкубации супернатант вируса собирали через 8, 10, 12, 14, 16 и 18 часов после адсорбции и хранили при -80 ° C. Полные вирусные РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя и количественно оценивали с помощью qRT-PCR с использованием праймеров, специфичных для CV-A6.

FITC Анализ обнаружения апоптоза аннексина V. Возможность апоптоза, индуцированного CV-A6 2C, была протестирована с использованием набора для обнаружения апоптоза аннексина V флуоресцеина (FITC) I (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) в клетках RD после протокол производителя.Клетки RD высевали в 12-луночный планшет и трансфицировали VR1012-Changchun046-2C-HA; VR1012-Changchun097-2C-HA; VR1012-Changchun098-2C-HA; и их управляющий вектор VR1012. Альтернативно, клетки RD, обработанные STS (конечная концентрация, 4 нМ; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), также включали в качестве положительного контроля. Через 48 часов после трансфекции (24 часа после обработки STS) клетки собирали, дважды промывали холодным PBS и ресуспендировали в 200 мкл 1 × связывающего буфера. Суспензию клеток (100 мкл) переносили в 5-миллилитровую культуральную пробирку и инкубировали с 5 мкл FITC-меченного аннексина V в течение 15 мин при комнатной температуре (25 ° C) в темноте.В каждую пробирку добавляли пятьсот микролитров 1 × буфера для связывания, и клетки анализировали с помощью проточной цитометрии BD FACSCalibur (BD Biosciences) для обнаружения флуоресценции FITC.

Обнаружение аутофагии с использованием флуоресцентной микроскопии. Клетки RD высевали на 24-луночные культуральные планшеты и выращивали до 60-70% конфлюэнтности. Клетки RD котрансфицировали CV-A6 2C и pEGFP-LC3 с использованием Lipofectamine2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Сигналы флуоресценции визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (IX83; Olympus, Токио, Япония) через 48 часов после трансфекции.

Статистический анализ. Значения клинических показателей и вирусной нагрузки были проанализированы с использованием теста непараметрического одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Выживаемость оценивалась с использованием логарифмического рангового теста. Данные о пролиферации клеток анализировали с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента t . Все результаты были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Значение P <0,05 считалось значимым.

Заболевания рук, ящура

Болезнь рук, ног и рта (HFMD) — это вирусная инфекция, которая вызывает сыпь или волдыри на руках и ногах, а также во рту или вокруг рта.Есть два типа вирусов, вызывающих HFMD, и симптомы различаются в зависимости от вируса.

HFMD в основном поражает детей в возрасте до 10 лет, но также может поражать подростков. Он легко передается от одного человека к другому. Можно заразиться вирусом более одного раза, но симптомы будут менее серьезными.

HFMD не связан с ящуром, который встречается у животных.

Признаки и симптомы HFMD

Симптомы обычно появляются через три-семь дней после заражения и могут длиться от семи до 10 дней.Если у вашего ребенка HFMD, он может чувствовать усталость, повышенную температуру и сыпь. В зависимости от того, каким вирусом заражен ваш ребенок, кожная сыпь может выглядеть так:

• Маленькие овальные белые волдыри на ладонях, подошвах стоп, а также во рту. У вашего ребенка могут быть боли во рту и горле, что приводит к плохому аппетиту или риску обезвоживания (питье и еда могут быть болезненными из-за волдырей во рту).
• Красная кожная сыпь с коричневой чешуей на ней. Сыпь появляется на внешних руках, руках, ногах, ступнях, вокруг рта и верхней части ягодиц.Ствол обычно относительно чистый. Иногда появляются волдыри, но обычно они не во рту, и ваш ребенок может есть и пить как обычно.

Волдыри не должны зудеть, как волдыри при ветряной оспе. Если у вашего ребенка экзема, HFMD может вызвать обострение экземы и потенциально инфицирование бактериями.

Как распространяется HFMD?

HFMD чаще всего вызывается вирусом Коксаки.Основной путь распространения HFMD — контакт с жидкостью изнутри волдырей или с каплями, распространяемыми при чихании и кашле. Вирус также может присутствовать в испражнениях (фекалиях) в течение нескольких недель после выздоровления человека.

Для предотвращения распространения HFMD:

• Тщательно мойте руки после прикосновения к жидкостям организма ребенка. Это включает в себя прикосновение к волдырям, помощь в высморкавании, смену подгузников или помощь с туалетом.
• Убедитесь, что ваш ребенок не пользуется общими предметами, такими как столовые приборы, чашки для питья, полотенца, зубные щетки и одежда.
• Не отпускайте ребенка в школу, детский сад или детский сад до тех пор, пока вся жидкость в его волдырях не высохнет.

Уход на дому

HFMD — это вирусная инфекция, которая редко вызывает дальнейшие осложнения. Антибиотики не действуют на вирусы и не назначаются детям с HFMD. HFMD поправится сама по себе, но есть способы заботиться о своем ребенке дома:

• Если ваш ребенок испытывает боль или дискомфорт, дайте ему обезболивающее, например парацетамол или ибупрофен.Не давайте аспирин. Смотрите наш информационный бюллетень Обезболивание для детей.
• Давайте ребенку часто пить воду или раствор для пероральной регидратации, чтобы предотвратить обезвоживание.
• Дать волдырям высохнуть естественным путем. Не протыкайте и не сжимайте их.
• Если ваш ребенок плохо себя чувствует, у него жар и кожная сыпь (маленькие ярко-красные пятна или пурпурные пятна или синяки необъяснимого характера), которые не меняют цвет кожи (бледнеют) при нажатии на него, это может быть признаком менингококковой инфекции. (см. наш информационный бюллетень Менингококковая инфекция).

Ключевые моменты, которые следует запомнить

• HFMD — легкое заболевание, которое вылечит само по себе.
• Два типа вирусов вызывают HFMD, и сыпь зависит от вируса, которым заражен ваш ребенок.
• HFMD легко передается от одного человека к другому.

Для получения дополнительной информации

Общие вопросы, которые задают нашим врачам

Опасен ли HFMD для беременных?

HFMD представляет опасность для беременных женщин и их будущих детей.

У моего ребенка все еще волдыри. Сможет ли она вернуться в школу?

Если жидкость в волдырях высохла, ваш ребенок может вернуться в школу.

Разработано отделениями неотложной помощи и инфекционного контроля Королевской детской больницы. Мы признательны потребителям и опекунам RCH.

Отзыв написан в феврале 2018 г.

Kids Health Info поддерживается Фондом Королевской детской больницы.Чтобы сделать пожертвование, посетите www.rchfoundation.org.au.

журналов поджелудочной железы | Список проиндексированных статей

JOP — это рецензируемый журнал с открытым доступом, который два раза в месяц публикует рукописи по соответствующим темам, включая этиологию, эпидемиологию, профилактику, генетику, патофизиологию, диагностику, хирургическое и медицинское лечение заболеваний поджелудочной железы, включая рак, воспалительные заболевания, сахарный диабет, клиническую практику. панкреатология, внутренние болезни, клинические исследования, желудочно-кишечная хирургия, эндокринология, гепатология, лечение острого панкреатита, диабета, протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и ее лечения, хронического панкреатита, нейроэндокринной опухоли, муковисцидоза и других врожденных заболеваний.

Представленные материалы включают оригинальные исследования, тематические исследования, нововведения в разработке программ, научные обзоры, теоретический дискурс и обзоры книг. Кроме того, Журнал поощряет представление ответственных предположений и комментариев. JOP. Журнал поджелудочной железы предоставляет актуальные обзоры и обновления, относящиеся к аномалиям поджелудочной железы и терапии, а также текущие аннотированные обзоры исследований, опубликованные в других местах, что делает журнал уникальным и ценным справочным ресурсом. Редакционная коллегия состоит из международных корифеев, которым поручено предоставлять читателям новейшую информацию, которая будет иметь большое значение для всех, кто работает в области исследований поджелудочной железы.

The JOP. Journal of Pancreas следует процессу простого слепого рецензирования для проверки качества и ценности каждой полученной рукописи. Рецензирование осуществляется под эгидой членов редакционной коллегии журнала. После первичной проверки качества каждая статья рецензируется сторонними экспертами под руководством назначенного редактора. Утверждение по крайней мере двух независимых рецензентов с последующим одобрением редактора является обязательным для принятия любой заявки.

Цитирование
Журнал индексируется: EBSCO, CNKI, ICMJE, THOMSON REUTERS ESCI (EMERGING SOURCES CITATION INDEX), COSMOS, BRITISH LIBRARY и University of Zurich — UZH

Связано с

Сеть сторонников панкреатита
Греческое общество поджелудочной железы и желчевыводящих путей
Белорусский панкреатический клуб

Заявление об открытом доступе

Это журнал с открытым доступом, который позволяет бесплатно получить весь контент для отдельного пользователя или любого учреждения.Пользователям разрешается читать, скачивать, копировать, распространять, распечатывать, искать или ссылаться на полные тексты статей или использовать их для любых других законных целей без предварительного разрешения издателя или автора при условии, что автор предоставлен должный кредит там, где это необходимо. Это соответствует определению открытого доступа BOAI.

Поджелудочная железа

Поджелудочная железа — это длинная плоская железа, расположенная в брюшной полости за желудком. Он производит несколько важных ферментов, которые попадают в тонкий кишечник и помогают пищеварению.Поджелудочная железа также содержит кластеры клеток, называемые островками. Клетки этих островков вырабатывают гормоны, такие как инсулин и глюкагон, которые помогают контролировать уровень глюкозы (типа сахара) в крови.

Связанные журналы поджелудочной железы

Поджелудочная железа, панкреатология, Журнал гепато-билиарно-панкреатических наук, гепатобилиарные и панкреатические заболевания International

Панкреатит

Панкреатит — это воспаление поджелудочной железы. Поджелудочная железа — это длинный ровный орган, расположенный за животом в верхней части живота.Поджелудочная железа вырабатывает ферменты, которые помогают пищеварению, и гормоны, которые помогают управлять процессом обработки сахара (глюкозы) вашим организмом. Поджелудочная железа может протекать как острый панкреатит, так и хронический панкреатит.

Связанные журналы панкреатита

Панкреатология, Медицинский журнал Новой Англии, Журнал гепато-билиарно-панкреатических наук, Международный вестник гепатобилиарных и панкреатических заболеваний

Функция поджелудочной железы

Поджелудочная железа — это две железы, которые тесно перемешаны в один орган.Первый функциональный компонент — «экзокринный», а второй функциональный компонент — «эндокринный». Экзокринные »клетки, вырабатывающие ферменты, помогающие переваривать пищу, а эндокринная поджелудочная железа состоит из небольших островков клеток, называемых островками Лангерганса.

Связанные журналы функции поджелудочной железы

Поджелудочная железа, заболевания и терапия поджелудочной железы, панкреатология, гепатобилиарные заболевания и заболевания поджелудочной железы International

Острый панкреатит

Острый панкреатит — это внезапное кратковременное воспаление поджелудочной железы.Другой термин, используемый для обозначения острого панкреатита, — это острый некроз поджелудочной железы. Несмотря на высокий уровень лечения, это может привести к серьезным осложнениям или даже смерти. В тяжелых случаях острый панкреатит приводит к кровотечению в железе, серьезному повреждению тканей, инфекции и образованию кист. Он также может нанести вред другим жизненно важным органам, таким как сердце, легкие и почки. Острый панкреатит диагностируется клинически, но иногда требуется компьютерная томография, полный анализ крови, функциональные тесты почек, визуализация и т. Д.

Связанные журналы острого панкреатита

Гастроэнтерология, эндоскопия желудочно-кишечного тракта, Американский журнал хирургии, панкреатологии, болезней органов пищеварения и печени

Хронический панкреатит

Хронический панкреатит — это постоянное воспаление поджелудочной железы, которое не излечивает и не улучшает, а изменяет нормальную структуру и функции органа.Обычно это наблюдается после приступа острого панкреатита. Еще одна важная причина — употребление алкоголя в больших количествах. Хронический панкреатит может проявляться как эпизоды сильного воспаления в поврежденной поджелудочной железе или как хроническое поражение с постоянной болью или нарушением всасывания. Диабет — частое осложнение, возникающее из-за хронического поражения поджелудочной железы, и требует лечения инсулином.

Связанные журналы хронического панкреатита
Гастроэнтерология, эндоскопия желудочно-кишечного тракта, Американский журнал хирургии, панкреатологии, болезней органов пищеварения и печени

Рак поджелудочной железы

Рак поджелудочной железы — злокачественное новообразование, возникающее из трансформированных клеток, возникающих в тканях, образующих поджелудочную железу.Рак поджелудочной железы (рак поджелудочной железы) в основном встречается у людей старше 60 лет. Если он диагностирован на ранней стадии, то операция по удалению рака дает некоторые шансы на излечение. В целом, чем более развит рак (чем больше он разросся и распространился), тем меньше шансов, что лечение будет излечивающим. Как экзокринные, так и эндокринные клетки поджелудочной железы могут образовывать опухоли. Но опухоли, образованные экзокринными клетками, встречаются гораздо чаще. Клетки рака поджелудочной железы не погибают программно, а продолжают расти и делиться.

Связанные журналы рака поджелудочной железы

Гастроэнтерология, эндоскопия желудочно-кишечного тракта, Европейский журнал рака, панкреатологии, Американский журнал хирургии

Сахарный диабет

Сахарный диабет — это группа метаболических заболеваний, характеризующихся недостаточностью инсулина гормона поджелудочной железы, которая возникает в результате нарушения секреции или действия инсулина, либо того и другого. Сахарный диабет Диабет — это хроническое заболевание, а это означает, что, хотя его можно контролировать, он сохраняется на всю жизнь.Существует три основных типа сахарного диабета: 1. СД 1 типа; 2. Тип 2 ДМ; 3. Гестационный диабет.

Связанные журналы сахарного диабета

Исследования и клиническая практика диабета, метаболизм, гастроэнтерология, панкреатология

Хирургия поджелудочной железы

Хирургия поджелудочной железы — сложная процедура и выполняется, когда это единственный вариант, который может привести к длительному выживанию при раке поджелудочной железы и, в некоторых случаях, возможно, имеет потенциальный шанс на излечение.Применяется для лечения хронического панкреатита и других, менее распространенных доброкачественных заболеваний поджелудочной железы. Панкреатодуоденэктомия Уиппла — это операция, наиболее часто выполняемая при опухолях головки поджелудочной железы. Он включает удаление части желудка, всей двенадцатиперстной кишки, части тонкой кишки, головки поджелудочной железы, желчного протока и желчного пузыря, оставляя после себя основные кровеносные сосуды. Основная цель хирургии поджелудочной железы — снятие трудноизлечимых болей и декомпрессия соседних органов.

Связанные журналы хирургии поджелудочной железы

Гастроэнтерология, Эндоскопия желудочно-кишечного тракта, Американский журнал хирургии, Журнал детской хирургии, Панкреатология, Журнал хирургических исследований, Ланцет, Хирургия, Европейский журнал рака, заболеваний пищеварительной системы и печени, Европейский журнал противораковых добавок, Журнал гастроинтестинальной хирургии

Аутоиммунный панкреатит

Аутоиммунный панкреатит (АИП) — это недавно обнаруженный тип хронического панкреатита, который трудно отличить от карциномы поджелудочной железы.Установлено, что аутоиммунный панкреатит (АИП) поддается лечению кортикостероидами, особенно преднизоном. В настоящее время это считается формой гипер-IgG4-болезни. Существует две категории AIP: Тип 1 и Тип 2, каждая с разными клиническими профилями. Пациенты с AIP типа 1, как правило, были старше и имели высокую частоту рецидивов, но пациенты с AIP типа 2 не испытывали рецидивов и, как правило, были моложе. AIP не влияет на долгосрочную выживаемость.

Связанный журнал аутоиммунного панкреатита

Гастроэнтерология, эндоскопия желудочно-кишечного тракта, панкреатология, заболевания органов пищеварения и печени, клиническая гастроэнтерология и гепатология, Отчет по гастроэнтерологии, Американский журнал рентгенологии, Медицинский журнал Новой Англии

Псевдокиста поджелудочной железы

Псевдокиста поджелудочной железы — это заполненный жидкостью мешок в брюшной полости, который иногда также содержит ткани, ферменты и кровь из поджелудочной железы.Псевдокиста поджелудочной железы обычно возникает у пациентов с хроническим панкреатитом. Он также может возникать у людей с травмой поджелудочной железы или после травмы живота. Псевдокиста поджелудочной железы развивается, когда протоки поджелудочной железы повреждены воспалением, возникающим при панкреатите. В отличие от настоящих кист, псевдокисты выстланы не эпителием, а грануляционной тканью. Другие осложнения, возникающие из-за псевдокисты поджелудочной железы, включают инфекцию, кровотечение, непроходимость, разрыв, сдавление мочевыделительной системы, желчевыводящей системы и артериовенозной системы.

Связанный журнал псевдокисты поджелудочной железы

Эндоскопия желудочно-кишечного тракта, Гастроэнтерология, Американский журнал хирургии, Журнал детской хирургии, панкреатология

Островковно-клеточная карцинома

Островоклеточная карцинома — это необычный рак эндокринной поджелудочной железы. На его долю приходится примерно 1,3% случаев рака поджелудочной железы. Он также известен как или несидиобластома. Опухоли из островковых клеток поджелудочной железы могут быть доброкачественными и злокачественными. Островковые клетки производят множество различных гормонов; большинство опухолей выделяют только один гормон, который вызывает определенные симптомы.Существуют различные типы островковых опухолей, такие как: гастриномы (синдром Золлингера-Эллисона), глюкагономы, инсулиномы. Опухоли островковых клеток поддаются лечению даже после метастазирования. Симптомы включают потливость, головную боль, голод, беспокойство, двоение в глазах или нечеткое зрение, учащенное сердцебиение, диарею, язвы в желудке и тонкой кишке, рвоту кровью и т. Д.

Реализованные журналы островково-клеточной карциномы

Гастроэнтерология, Американский журнал хирургии, Ланцет, Патология человека, Американский медицинский журнал

Трансплантация поджелудочной железы

Трансплантация поджелудочной железы — это передача здоровой поджелудочной железы от донора пациентам с диабетом.Поскольку поджелудочная железа является жизненно важным органом, родная поджелудочная железа пациента остается на месте, а пожертвованная поджелудочная железа помещается в другое место. Это делается потому, что в случае отторжения новой поджелудочной железы у пациента разовьется тяжелый диабет, и он не смог бы выжить без сохранившейся родной поджелудочной железы. Здоровая поджелудочная железа поступает от только что умершего донора или от человека с мертвым мозгом. В настоящее время трансплантация поджелудочной железы обычно проводится людям с тяжелым инсулинозависимым диабетом.

Связанные журналы трансплантации поджелудочной железы

Процедуры трансплантации, гастроэнтерология, панкреатология, The Lancet, Американский журнал хирургии, журнал хирургических исследований

Муковисцидоз

Муковисцидоз (МВ) — это аутосомно-рецессивное генетическое заболевание, поражающее легкие, поджелудочную железу, печень и кишечник. Его основная характеристика — нарушенный транспорт хлоридов и натрия через эпителий, что приводит к густым вязким секретам.Он также известен как муковисцидоз. Ненормальное дыхание — самый серьезный симптом, возникающий в результате частых инфекций легких. Муковисцидоз вызывается мутацией сдвига рамки считывания в гене белка трансмембранного регулятора проводимости (CFTR). Название муковисцидоз было дано из-за образования кисты в поджелудочной железе. Густая секреция слизи, возникающая из-за муковисцидоза, блокирует путь пищеварительных и эндокринных ферментов поджелудочной железы, вызывая полное повреждение поджелудочной железы.

Связанные журналы муковисцидоза

Журнал муковисцидоза, Журнал педиатрии, гастроэнтерологии, Ланцет, Журнал детской хирургии, Журнал аллергии и клинической иммунологии, Журнал трансплантации сердца и легких, Американский журнал хирургии, респираторной медицины, Американский журнал медицины

Патофизиология

Патофизиология или физиопатология — это соединение патологии с физиологией. Патология описывает состояния во время болезненного состояния, тогда как физиология — это дисциплина, которая описывает механизмы, действующие в организме.Патология описывает ненормальное состояние, тогда как патофизиология пытается объяснить физиологические процессы, из-за которых такое состояние развивается и прогрессирует. Другими словами, патофизиология определяет функциональные изменения, связанные с заболеванием или травмой.

Связанные журналы патофизиологии

Гастроэнтерология, панкреатология, биологическая психиатрия, журнал Американского колледжа кардиологии, патофизиология

Искусственная поджелудочная железа

Искусственная поджелудочная железа — это технология, разработанная, чтобы помочь людям с диабетом автоматически контролировать уровень глюкозы в крови, обеспечивая замену инсулина здоровой поджелудочной железы.Основная цель искусственной поджелудочной железы — обеспечить эффективную заместительную инсулиновую терапию, чтобы контроль уровня глюкозы в крови был нормальным и не было осложнений гипергликемии. Искусственная поджелудочная железа облегчает лечение инсулинозависимых. Эту систему носят как инсулиновую помпу и называют «искусственной поджелудочной железой», потому что она контролирует и регулирует уровень инсулина так же, как поджелудочная железа у людей без диабета.

Связанные журналы искусственной поджелудочной железы
Гастроэнтерология, панкреатология, Медицинский журнал Новой Англии, Американский журнал хирургии, исследований диабета и клинической практики, метаболизм

Кольцо поджелудочной железы

Кольцо поджелудочной железы — редкое заболевание, при котором часть ткани поджелудочной железы разрастается и окружает двенадцатиперстную кишку.Эта дополнительная ткань возникает из головки поджелудочной железы. Это вызывает сужение двенадцатиперстной кишки, блокируя поступление пищи в оставшуюся часть кишечника. Частота возникновения кольцевидной железы поджелудочной железы составляет 1 случай на 12–15 000 новорожденных. Обычно это происходит из-за аномального или экстраэмбриологического развития. Однако также сообщалось о некоторых случаях заболевания у взрослых. Ранние признаки аномалии включают многоводие, низкий вес при рождении и непереносимость кормления сразу после рождения.

Связанные журналы кольцевидной железы поджелудочной железы

Журнал детской хирургии, Американский журнал хирургии, желудочно-кишечная эндоскопия, ультразвук в медицине и биологии, клиники и исследования в области гепатологии и гастроэнтерологии

Заболевания поджелудочной железы

Поджелудочная железа — это орган, который играет важную роль в пищеварении и производстве гормонов.Заболевания поджелудочной железы включают острый панкреатит, наследственный панкреатит и рак поджелудочной железы. В журнале собрана информация о заболеваниях поджелудочной железы, методах выявления, различных методах лечения и передовых методах лечения заболеваний поджелудочной железы.

Связанные журналы заболеваний поджелудочной железы

Pancreatic Disorders & Therapy, Journal of Hepato-Bili-Pancreatic Sciences, Международный журнал гепатобилиарных и панкреатических заболеваний, Журнал гастроэнтерологии, панкреатологии и заболеваний печени

Использование вируса Коксаки B3 в качестве модели острого панкреатита

1.Введение

Острый панкреатит — серьезное гастроэнтерологическое заболевание, характеризующееся воспалением и повреждением экзокринной части поджелудочной железы. Как правило, это самоограничение, но до 20% случаев развиваются тяжелые клинические осложнения, приводящие к тяжелому острому панкреатиту с последующей смертностью до 30% (25, 39, 40). Тяжелый острый панкреатит связан с системным воспалением, полиорганной недостаточностью и высокой смертностью. К сожалению, в настоящее время не существует специальной фармакотерапии для лечения или предотвращения прогрессирования этого заболевания.

Наиболее частыми этиологическими факторами, связанными с острым панкреатитом у взрослых, являются камни в желчном пузыре и злоупотребление алкоголем, хотя в 20–30% случаев причина неизвестна (6). Напротив, общие этиологические факторы у детей включают лекарства, инфекции, травмы и анатомические аномалии (32). Интересно, что в обзоре литературы Бенифла и Вейцман сообщили, что примерно 10% случаев острого панкреатита у детей были вызваны вирусными инфекциями (3).

Известно, что ряд вирусов размножаются в поджелудочной железе и вызывают панкреатит; Среди них — вирусы Коксаки (26).Вирусы Коксаки — это энтеровирусы, которые чаще всего связаны с миокардитом у людей. Вирусы Коксаки делятся на две группы A и B, состоящие из 24 и 6 серотипов соответственно. Вирусы Коксаки группы B являются обычными патогенами человека. Хотя эти вирусы обычно связаны с сердечными заболеваниями, они были выделены из поджелудочной железы пациентов с панкреатитом (11, 26, 46). Кроме того, было показано, что вирусы Коксаки реплицируются с высокими титрами в поджелудочной железе и вызывают обширное повреждение ткани поджелудочной железы в экспериментальных моделях животных (30, 34).Фактически, у мышей, если эти вирусы не реплицируются с высоким титром в поджелудочной железе, они не вызывают сердечных заболеваний (13, 34). Кроме того, вспышки инфекций, ассоциированных с вирусом Коксаки, были связаны с увеличением случаев панкреатита (20, 21). Хотя вирусная инфекция является более частой причиной острого панкреатита у детей, отдельные исследования показали, что вирус Коксаки является причиной острого панкреатита у взрослых (7, 9, 16). Кроме того, несколько исследований выявили повышенные титры антител против вируса Коксаки у пациентов с острым панкреатитом (2, 4, 23).За пятилетний период Ozsvar et al. наблюдал повышенные титры антител против вирусов Коксаки у 34% пациентов с острым, рецидивирующим или хроническим панкреатитом (23). Таким образом, очевидно, что инфекция человека вирусом Коксаки может вызвать острый панкреатит.

Независимо от этиологии острого панкреатита, исходное событие, ответственное за начало заболевания, считается общим для всех, а именно неправильная активация пищеварительных ферментов поджелудочной железы и самопереваривание органа (36).Создан ряд доклинических моделей острого панкреатита на животных. К ним относятся гиперстимуляция поджелудочной железы ортологом холецистокинина, церулеин, перевязка желчных протоков, вливание солей желчных кислот в проток поджелудочной железы, изменение диеты и введение основных аминокислот (17). Хотя с помощью этих моделей было получено огромное количество информации о молекулярных событиях, которые приводят к острому панкреатиту, ни одно из этих поражений поджелудочной железы не происходит у людей.Следовательно, физиологическое значение этих моделей для острого панкреатита у людей неясно. Из-за этого одним из ограничений в изучении поражения поджелудочной железы и острого панкреатита у людей является нехватка животных моделей, которые биологически значимы для острого панкреатита у людей. Используя вирусы Коксаки 3-го серотипа (CVB3) группы B, выделенные от людей, которые страдали от инфекций CVB3, мы создали модель острого панкреатита, которая физиологически связана с этим заболеванием у людей.

2. Материалы и реагенты

2.1 Материалы

1. Агароза
2. Порошковая модифицированная среда Орла Дульбекко
3. Фетальная бычья сыворотка
4. Ротор и трубки Bechman SW 28 или SW 41
5. Формальдегид
6. Кристально-фиолетовый
7. Стеклянные гомогенизаторы (Тканевые шлифовальные машины Dounce)
8. 12-луночные планшеты для культивирования тканей

2.2 Реактивы

а.Приготовление 0,5% агарозы / DMEM

0,5% раствор агарозы / DMEM получают путем приготовления 2 отдельных растворов: 1% раствора агарозы и раствора 2X DMEM. 1% раствор агарозы готовят путем добавления 1 грамма агарозы на 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием. Затем раствор агарозы охлаждают на водяной бане до 55 90 379 o ° С. 2-кратный раствор DMEM готовят, добавляя вдвое больше рекомендованной массы порошкообразного DMEM и бикарбоната натрия к объему, который вы хотите приготовить (обычно 100 мл).Доводят pH до 7,2, стерилизуют фильтрованием через фильтр 0,22 мкм и нагревают до 55 ^— ° C. 0,5% раствор агарозы / DMEM готовят путем объединения равных объемов агарозы и 2X растворов DMEM непосредственно перед его использованием. для наложения ячеек.

г. Приготовление 20% формалина

Формалин — это базовый раствор 37% формальдегида. Для приготовления 20% -ного формалина основной раствор формалина разбавляют 1: 5 дистиллированной водой, получая 7.4% формальдегид

г. Приготовление 1% кристаллического фиолетового

Кристаллический фиолетовый получают добавлением 5 г кристаллического фиолетового к 395 мл H ₂ O и 105 мл 20% этанола. Затем раствор фильтруют через фильтр 0,22 мкм.

3. Методы

CVB3 являются патогенами человека (26, 34). Из-за этого при работе с CVB3 необходимо соблюдать меры предосторожности BSL2. Вся работа с этими вирусами должна выполняться в утвержденном шкафу биобезопасности типа II, а любое потенциально зараженное оборудование или твердые отходы должны быть обеззаражены 10% -ным раствором отбеливателя или автоклавированием.После работы с тканями или растворами, которые могут быть загрязнены CVB3, все поверхности необходимо очистить 10% раствором отбеливателя.

Штаммы CVB3, которые мы используем, являются патогенами человека, выделенными от людей, перенесших инфекцию CVB3. Эти вирусы не были адаптированы для мышей, но вызывают заболевание у мышей, подобное тому, которое наблюдается у людей (34). По этой причине мы культивируем вирус в клеточных линиях человеческого происхождения, обычно в клетках HeLa.

а.Вирусный рост и изоляция

1. Клетки HeLa высевают в колбу 5 × 10 ⁶ клеток / 75 см ² (концентрация, которая дает примерно 80% слияния) и инкубируют в течение ночи.
2. На следующий день питательную среду (DMEM, содержащую 10% FBS и антибиотики) удаляют путем осторожной аспирации, чтобы не повредить клеточный лист. Клетки инфицированы вирусом при множественности инфицирования (MOI) 0,01-0,001 в 5 мл объема DMEM, содержащего 2% FBS.Например, мы заражаем эти культуры 5 x 10 ⁴ бляшкообразующими единицами (БОЕ). Этот низкий MOI используется для ограничения образования дефектных мешающих частиц.
3. Инфицированные клетки инкубируют при 37 ^o ° C в течение 30 минут при периодическом встряхивании.
4. Вирусный посевной материал удаляют путем аспирации и заменяют питательной средой. Затем колбы инкубируют в течение 2-3 дней при температуре 37 90 379 o ° C до тех пор, пока клеточный лист не будет разрушен.
5. Колбы подвергают 3 циклам замораживания / оттаивания при -70 ^o ° C и собирают супернатант, содержащий вирус.
6. Клеточный мусор удаляется центрифугированием в роторе SW28 при 25000 об / мин при 8 ^° ° C в течение 30 минут или в роторе SW41 при 25000 об / мин при 8 ^° ° C в течение 20 минут. Освещенный вирус, содержащий супернатант, собирают и хранят при -70 ^o ° C. Если компоненты, присутствующие в среде для выращивания, не вызывают беспокойства в экспериментах, можно использовать этот осветленный супернатант.
7. Если необходим вирус, лишенный компонентов питательной среды, вирус можно дополнительно очистить центрифугированием через сахарозу.Используя пробирки SW28, добавьте 12 мл 30% сахарозы, приготовленной в 1 М NaCl, 50 мМ Трис (pH 7,5). Культуральный супернатант осторожно капают по стенке пробирки так, чтобы он образовал слой поверх сахарозы. Аналогичным образом в пробирку капают 4 капли глицерина. Образцы центрифугируют при 25000 об / мин в течение ночи при 8 ^o C.
8. Супернатант удаляют, стараясь не повредить рыхлый и едва видимый осадок. Вирус суспендируют в 0,1 М NaCl, осторожно покачивая осадок.Очищенный вирус хранится при -70 ^o C.
9. Вирус титруют, как описано ниже. Примечание: препараты вируса Коксаки В разлагаются при -20 ^o C на титруемое количество за одну неделю; таким образом, длительное хранение должно быть при -70 ^o C.

б. Титрование вирусов с помощью анализа зубного налета

Мы используем клетки HeLa для выращивания и титрования CVB3.

1. При титровании вируса из тканей ткань взвешивают и переносят в стеклянный гомогенизатор (Dounce Tissue Grinders).
2. Добавляют 10-кратный объем DMEM, содержащий 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), и ткань гомогенизируют с помощью 20-30 движений. Например, 1 мл DMEM добавляют к образцу ткани весом 100 мг. Фактически это разбавление образца ткани 1:10, которое необходимо учитывать при расчете окончательного титра вируса.
3. Приготовьте 10-кратные разведения гомогената ткани или раствора, содержащего вирус (100 микролитров на 900 микролитров) в среде DMEM, содержащей 2% FBS.
4. 12-луночные планшеты засевают при плотности 2 × 10 ⁵ клеток HeLa / лунку и инкубируют в течение ночи.Это приведет к тому, что на следующее утро скважины сливаются примерно на 80%.
5. Каждое интересующее разведение анализируют в трех экземплярах (три лунки), заменяя питательную среду 250 микролитрами соответствующего разведения.
6. Планшеты инкубируют при 37 ^o ° C в течение 1 часа, осторожно покачивая каждые 15 минут.
7. Вирус, содержащий раствор, удаляют, и каждую лунку осторожно покрывают 1 мл 0,5% агарозы / DMEM, стараясь не наносить раствор пипеткой непосредственно на клеточный лист.
8. Агарозе дают затвердеть при комнатной температуре, планшеты переносят в инкубатор и инкубируют при 37 ^o ° C в течение 2 дней.
9. После инкубации образцы фиксируют, добавляя 1 мл 20% формалина в каждую лунку и инкубируя при комнатной температуре в течение 15 минут. Это инактивирует вирус.
10. Формалин удаляется из лунок, и слой агарозы удаляется из лунок шпателем, стараясь не поцарапать клеточный лист.
11. Затем фиксированные клетки окрашивают 0,5 мл 1% кристаллического фиолетового в течение 1-2 минут.
12. Кристаллический фиолетовый удаляют, и лунки 2-3 раза промывают H ₂ O. Бляшки видны в виде прозрачных участков на клеточном листе ( Рисунок 1 ). Скорее всего, одна или несколько лунок будут содержать слишком много бляшек для точного подсчета или вообще не содержать бляшек. Титр выражается в БОЕ / грамм ткани или БОЕ / мл (в зависимости от исходного материала).
13. Титр вируса определяется путем подсчета количества бляшек в трех лунках данного разведения.Подсчитанное количество бляшек делится на три (количество лунок / разведение), а затем умножается на 4 (поскольку в каждую лунку добавляется только 0,25 мл вирусного раствора). Это даст БОЕ / г или БОЕ / мл.
14. Пример : Готовят планшет, содержащий вирус, разведенный до 10 ^-6 , 10 ^-7 , 10 ^-8 , 10 ^-9 . На трех 10 ^-7 лунках подсчитывают 4, 5 и 6 бляшек, всего 15 бляшек (, рис. 1, ).

Расчеты: (15 бляшек) / (3 лунки) * 4 = 20 БОЕ.

Поскольку бляшки были подсчитаны при разведении 10 ^-7 , титр вируса составляет 20 × 10 ⁷ или 2,0 × 10 ⁸ БОЕ / мл.

Рис. 1. Анализ зубного налета. Репрезентативный планшет для анализа зубного налета . Лунки засевали клетками HeLa при плотности 2 × 10 ⁵ / лунку и инкубировали в течение ночи. На следующий день клетки инфицировали и покрывали 0,5% агарозой / DMEM, как описано в тексте. Планшеты инкубировали в течение двух дней, клетки фиксировали, наложения агарозы удаляли и клеточный лист окрашивали кристаллическим фиолетовым.Было обнаружено 15 бляшек при разведении 10 ^-7 , следовательно, титр вирусного образца составлял 2 × 10 ⁸ / мл.

г. Вирусная инфекция и возникновение панкреатита

Было показано, что репликация CVB3, а также патогенез, индуцированный инфекцией CVB3 в сердце мышей, зависят от штамма вируса и штамма мышей, использованных в исследовании (12, 42). Важно отметить, что вирулентность и, возможно, течение болезни зависят от конкретного штамма вируса и генетического состава мышей, причем некоторые штаммы вирусов являются авирулентными, а некоторые штаммы мышей более устойчивы к вирусу, чем другие. (14, 34).Из-за этого вирусный инокулят будет варьироваться в зависимости от штамма мышей и используемого вируса. Если вирулентный штамм вируса используется для восприимчивого штамма мышей, у всех животных разовьется панкреатит. CVB3 / CO и CVB3 / 28 вызывают явное повреждение поджелудочной железы у мышей C57BL / 6 или Balb / c. Напротив, CVB3 / GA инфицирует поджелудочную железу, но не вызывает гистологических повреждений (33, 34). Мышей содержат на стандартном лабораторном питании и воде ad libitum, если экспериментальные процедуры не требуют иного. Обычно мы прививаем мышей внутрибрюшинной (IP) инъекцией 0.2 мл вируса с титром вируса 2,5 × 10 ⁶ БОЕ / мл (5 × 10 ⁵ БОЕ / мышь) в шкафу безопасности типа II. Поскольку CVB3 является патогеном человека, а также мыши, инфицированные патогеном, животные могут заразить других мышей или сотрудников лаборатории. Поэтому после заражения мышей содержат в специально отведенном для этого помещении ABL2. Нормальная передача CVB3 — оральные фекалии, поэтому пища и постельные принадлежности могут быть загрязнены, и с ними следует обращаться как с таковыми.

Гистологический анализ ткани поджелудочной железы мышей, инфицированных CVB3, демонстрирует обширное воспаление экзокринной части поджелудочной железы и некроз ацинарных клеток в соответствии с классификацией умеренного острого панкреатита у людей, высокой заболеваемостью без смертности.Воспалительный инфильтрат в основном состоит из моноцитов (Т-лимфоцитов, В-клеток и естественных киллеров) (27, 28). Хотя было показано, что некоторые штаммы вируса Коксаки вызывают повреждение островков, подавляющее большинство штаммов CVB вызывают обширное повреждение ацинарных клеток, но не затрагивают островки и протоки (19, 45, 46) ^, (37). Хотя есть некоторые разногласия относительно механизма, с помощью которого CVB вызывает повреждение ткани поджелудочной железы, похоже, что повреждение, наблюдаемое в поджелудочной железе мышей, инфицированных вирусом Коксаки, является результатом вирус-индуцированного цитолиза, самопереваривания ферментами поджелудочной железы и клеточно-воспалительного повреждения ткани. (10, 19, 27, 28).

У экспериментально инфицированных мышей вирусные титры в селезенке достигают пика через 2-4 дня после заражения (PI) (30). Из-за сильно сосудистой природы селезенки титр в селезенке предположительно представляет собой титр в крови (уровень виремии) инфицированных животных. Уровни амилазы и липазы в сыворотке достигают пика через 4 дня, после чего они возвращаются к почти нормальным уровням (30). Пик повреждения ткани поджелудочной железы наступает примерно через 6 дней ИП. Хотя поражена большая часть поджелудочной железы, можно обнаружить непораженные участки.Пораженные участки характеризуются обширным некрозом, отеком и инфильтрацией воспалительных клеток ( Рисунок 2C ). После пика повреждения пораженные участки экзокринной части поджелудочной железы демонстрируют признаки восстановления с повторным появлением различимой архитектуры поджелудочной железы и организации ацинарных клеток в ацинусы. Этот процесс восстановления очевиден через 8 дней PI ( Рисунок 2D ). К двенадцати дням после заражения многие области выглядят нормально. Мы наблюдали накопление внутрипанкреатического жира в процессе регенерации мышей C57BL / 6, инфицированных CVB3 / CO (, рис. 2F, ).Этот жир сохраняется и накапливается с течением времени. Интересно, что это накопление жира в поджелудочной железе ослаблено у других линий мышей и наблюдается полная регенерация поврежденной поджелудочной железы (45). Таким образом, похоже, что регенеративный ответ на инфекцию CVB3 у мышей зависит от штамма мышей и, возможно, характеристик конкретного штамма вируса.

4. Обсуждение

Мы создали физиологически релевантную доклиническую модель острого панкреатита.В этой модели используются вирусы Коксаки, выделенные от людей, перенесших инфекцию CVB3. Важно отметить, что эти вирусы не гуманизированы и повторяют многие гистологические изменения, наблюдаемые при остром панкреатите человека (34).

У экспериментально инфицированных мышей самый высокий титр вируса в селезенке наблюдается через 2-4 дня после заражения (PI). Из-за сильно сосудистой природы селезенки титр в селезенке предположительно представляет собой титр в крови (уровень виремии) инфицированных животных.Пик повреждения ткани поджелудочной железы наступает примерно через 6 дней ИП. Хотя поражена большая часть поджелудочной железы, можно обнаружить непораженные участки. Пораженные участки характеризуются обширным некрозом, отеком и инфильтрацией воспалительных клеток ( Рисунок 2C ). После пика повреждения пораженные участки экзокринной части поджелудочной железы продемонстрировали признаки восстановления с повторным появлением различимой архитектуры поджелудочной железы и организации ацинарных клеток в ацинусы. Этот процесс ремонта очевиден через 8 дней после операции.К двенадцати дням после заражения многие области выглядят нормально. Мы наблюдали накопление внутрипанкреатического жира в процессе регенерации мышей C57BL / 6, инфицированных CVB3 / CO (, рис. 2F, ). Этот жир сохраняется и накапливается с течением времени. Интересно, что это накопление жира в поджелудочной железе ослаблено у других линий мышей. Таким образом, похоже, что регенеративный ответ на инфекцию CVB3 у мышей зависит от штамма мышей и характеристик конкретного штамма вируса.Интересно, что заражение людей вирусом паротита и мышей реовирусом 1 и 2 также вызывает жировое замещение поджелудочной железы (38, 41).

Фигура 2. Гистология поджелудочной железы после заражения CVB3 / CO мышей C57BK / 6 . Мышей инфицировали 5 × 10 ⁵ БОЕ / мл CVB3 / CO. Животных умерщвляли в указанные сроки после заражения и собирали поджелудочную железу. Поджелудочную железу фиксировали и срезы окрашивали гематоксилином и эозином.A) неинфицированное животное, B) через 2 дня после обнаружения инфекции воспаление, C) через 4 дня после инфекции очевиден отек, воспаление и некроз ацинарных клеток, D) через 8 дней после инфекции очевидны признаки репарации с повышенным присутствием ацинарных клеток и acini, E) через 12 дней после инфицирования большая часть острых повреждений разрешается, и многие доли поджелудочной железы кажутся нормальными, F) через 14 дней после инфицирования очевидно накопление внутрипанкреатического жира.

Накопление жира в поджелудочной железе мышей C57BL / 6, инфицированных CVB3 / CO, может быть полезной моделью неалкогольной жировой болезни поджелудочной железы (NAFPD).Недавно было описано, что NAFPD ассоциируется со снижением функции поджелудочной железы и повышенным риском сахарного диабета (22, 43). Большое поперечное исследование показало, что жирная поджелудочная железа присутствовала у 35% пациентов, поступивших на медицинский осмотр, что свидетельствует о ее распространенности (18).

Важно отметить, что инфекция CVB3 обычно не затрагивает островки поджелудочной железы. Таким образом, использование этой модели позволяет изучать как экзокринные, так и эндокринные нарушения поджелудочной железы при наличии повышенного внутрипанкреатического жира.

вызывают стойкую инфекцию со сниженной цитопатологией в сердцах экспериментально инфицированных мышей и естественно инфицированных людей, а также в поджелудочной железе инфицированных мышей (5, 15, 35). Таким образом, вероятно, что CVB3 также может сохраняться в поджелудочной железе человека. Стойкая инфекция поджелудочной железы CVB3 может играть роль в ряде заболеваний поджелудочной железы. Например, у пациентов с хроническим панкреатитом сообщалось о повышенных титрах антител к вирусу Коксаки (23).Напротив, возможно, что стойкая инфекция CVB3 увековечивает низкий уровень воспалительной реакции или что продолжающаяся экспрессия белков вируса Коксаки изменяет важные клеточные функции. Следовательно, не исключено, что стойкая инфекция CVB3 может быть вовлечена в другие заболевания поджелудочной железы, такие как аутоиммунный панкреатит и рак поджелудочной железы (5). Кроме того, накопление жира в поджелудочной железе мышей C57BL / 6, инфицированных CVB3 / CO, спустя долгое время после разрешения острой инфекции поджелудочной железы, возможно, может быть связано с персистирующей инфекцией поджелудочной железы CVB3.

В то время как NAFPD недавно стал важным фактором дисфункции поджелудочной железы, злоупотребление алкоголем долгое время ассоциировалось как с острым, так и с хроническим панкреатитом. Злоупотребление алкоголем считается этиологией примерно в 35% случаев острого панкреатита у взрослых (39). Принято считать, что злоупотребления алкоголем недостаточно, чтобы спровоцировать острый панкреатит, и, вместо того, чтобы инициировать панкреатит, алкоголь повышает чувствительность поджелудочной железы к некровоспалительным заболеваниям (1, 24, 29, 44).Наша лаборатория объединила вызванную CVB3 модель острого панкреатита с введением этанола мышам. Мы обнаружили, что введение этанола обостряет вызванный CVB3 панкреатит (8, 14, 30). Особое значение имеет то, что использование CVB3-индуцированного острого панкреатита в качестве модели острого алкогольного панкреатита физиологически актуально для человека, поскольку сочетает введение этанола с триггером, который, как известно, вызывает острый панкреатит у людей.

Таким образом, вирусы Коксаки могут вызывать панкреатит у мышей.Степень повреждения ткани и регенерация ткани поджелудочной железы зависит от генетического фона мыши и штамма вируса. Острый панкреатит, индуцированный CVB3, физиологически связан с острым панкреатитом человека, поскольку он использует человеческие патогены, которые, как известно, вызывают панкреатит. Индукция CVB3-индуцированного острого панкреатита проста, требует только одной внутрибрюшинной инъекции, позволяет избежать инвазивных процедур, имеет высокую воспроизводимость и низкую частоту осложнений, приводящих к летальному исходу.CVB3 вызывает более тяжелую форму острого панкреатита, чем обычно используемая модель введения церулеана, и, таким образом, может иметь большее значение в исследованиях, посвященных изучению эффективности фармакологических агентов для лечения или предотвращения прогрессирования этого заболевания. Этот инфекционный способ инициирования острого панкреатита физиологически релевантен случаям острого панкреатита человека с использованием человеческого патогена, не адаптированного к животным. В настоящее время возможности лечения острого панкреатита ограничены, а показатели смертности существенно не улучшились в течение нескольких десятилетий; Частично это объясняется отсутствием моделей на животных, которые отражают патофизиологию болезней человека (31).