Повышенный гипертонус у новорожденного: Гипертонус у новорожденных в Люберцах и Лыткарино — цены и запись на консультацию к клинику 100med

Гипертонус у младенцев

Синдром мышечной гипертонии характеризуется увеличением сопротивления пассивным движениям, ограничением спонтанной и произвольной двигательной активности, повышением сухожильных рефлексов, расширением их зоны, клонусами стоп.

Выраженность синдрома мышечной гипертонии может варьировать от легкого повышения сопротивления пассивным движениям до полной скованности. Если мышечный гипертонус выражен не резко, не сочетается с патологическими тоническими рефлексами и другими неврологическими нарушениями, его влияние на развитие ребенка может проявляться в легкой задержке двигательных навыков. А также бывает, что моторное развитие идет по возрасту и ребенок вовремя начинает сидеть, вставать и ходить, но при этом упор ног у ребенка осуществляется на носочек, что приводит к нарушению походки. Длительная ходьба на носочках может привести к укорочению ахилловых сухожилий, что исправляется только оперативным лечением.

Если ребенок вял, неактивен мало двигается, ручки и ножки вяло лежат вдоль тела, малыш не пытается взять игрушку, перевернуться, удержать голову — это значит, что напряжение мышц снижено — мышечная гипотония или гипотонус. Количество импульсов, которое поступает из центральной нервной системы к мышцам значительно снижено.

Синдром мышечной гипотонии характеризуется снижением сопротивления пассивным движениям и увеличением их объема. Ограничена спонтанная и произвольная двигательная активность. Сухожильные рефлексы могут быть нормальными, повышенными, сниженными или отсутствовать, в зависимости от уровня поражения нервной системы. Гипотония может трансформироваться в нормотонию, дистонию, гипертонию или оставаться ведущим симптомом на протяжении всего первого года жизни.

Если мышечная гипотония не резко выражена и не сочетается с другими неврологическими нарушениями, она, либо не оказывает влияние на возрастное развитие ребенка, либо вызывает запаздывание моторного развития, чаще во втором полугодии жизни.

Синдром двигательных нарушений у детей первого года жизни может проявляться мышечной дистонией — состоянием, когда мышечная гипотония чередуется с гипертонией, то есть мышечный тонус постоянно меняется. О мышечной дистонии также говорят, когда у ребенка одни мышцы слишком расслаблены, а другие наоборот, слишком напряжены.

Выраженный синдром мышечной дистонии может привести к задержке моторного развития или к двигательным нарушениям (например нарушение походки). Синдром преходящей мышечной дистонии не оказывает существенного влияния на возрастное моторное развитие ребенка.

Нарушения мышечного тонуса часто обусловлены возникновением проблем в работе центральной нервной системы — головного или спинного мозга, и чаще всего являются следствием гипоксии и ишемии. Гипоксия — это состояние, при котором организм малыша, центральная нервная система испытывают недостаток кислорода. Ишемия — это нарушение кровоснабжения тканей, ведущее к гипоксии.

Нарушение мышечного тонуса встречаются при серьезных тяжелых заболеваниях нервной системы, таких как различные формы миопатий, спинальные мышечные атрофии, миастения, а также быть следствием воспалительных, сосудистых и травматических заболеваний нервной системы, всегда отмечается при детском церебральном параличе.

Выявление нарушений мышечного тонуса требует наблюдения детского невролога . При необходимости специалист назначит дополнительные методы исследования .

Лечение нарушений мышечного тонуса

1. Лечебный массаж и гимнастика.
2. Физиотерапевтические, в том числе тепловые и электро- процедуры.
3. Водные процедуры, расслабляющие или тонизирующие ванны, плавание.
4. Упражнения на фитболе.
5. Медикаментозное лечение: препараты из группы ноотропов, сосудистые, седативные, нейрометаболические, витаминные препараты.

В большинстве случаев у детей с легкими нарушениями мышечного тонуса удается восстановить работу центральной нервной системы и достичь нормотонии.

Источники:
www.e-motherhood.ru, www.mobilmed.ru, xn--80achd5ad.xn--p1ai, dodoctor.by

Следующие материалы:

13 мая 2021 года

Гипертонус мышц — обзор

Спастичность и ригидность

Гипертонус обычно наблюдается после тяжелой ЧМТ. Гипертония — это повышенное сопротивление пассивным движениям и может иметь несколько причин. Важно учитывать разные причины гипертонии, поскольку для каждой из них используются разные стратегии лечения.

Спастичность — это форма гипертонии, которая определяется как зависящее от скорости сопротивление пассивному растяжению мышц. Между скоростью, с которой мышца растягивается (или движется сустав), и сопротивлением движению существует положительная взаимосвязь.Контроль мышечного тонуса включает петлю обратной связи, которая объединяет информацию об активности, положении и скорости мышц. ¹⁹⁰ При повреждении ЦНС после ЧМТ может наблюдаться потеря нисходящих тормозящих влияний в пути рефлекса растяжения мышц, что приводит к спастичности.

Существует несколько фармакологических средств, используемых для лечения спастичности после ЧМТ. Большинство агентов действуют на ЦНС, облегчая тормозящие воздействия на рефлекс растяжения мышц, который может быть снижен из-за повреждения ЦНС после ЧМТ.Бензодиазепины были первым классом лекарств, используемых для лечения спастичности. В семействе бензодиазепинов для лечения спастичности чаще всего используется диазепам. Диазепам агонизирует рецептор GABA _A , что приводит к гиперполяризации и подавлению оттока из ретикулярной формации ствола мозга и нисходящих путей спинного мозга. ¹⁹¹ Бензодиазепины, однако, как правило, следует избегать в качестве средств первой линии для лечения спастичности из-за седативных эффектов и известного ингибирования нейропластичности.

Баклофен также является агонистом ГАМК, который обычно используется для лечения спастичности. В отличие от диазепама, который является агонистом рецептора GABA _A , баклофен является агонистом GABA _B . Это вызывает гиперполяризацию клетки как на пресинаптическом, так и на постсинаптическом уровнях, что приводит к ингибированию как моносинаптических, так и полисинаптических рефлекторных путей. ¹⁹⁰ Большая часть исследований по применению баклофена для лечения спастичности проводилась в популяциях с повреждениями спинного мозга и рассеянным склерозом.Систематических исследований среди населения с черепно-мозговой травмой проводилось мало. Ожидается, что седативный эффект баклофена будет меньше, чем у диазепама; Однако следует контролировать седативный эффект и предупреждать пациентов об этом потенциальном побочном эффекте. Следует избегать резкой отмены, потому что были случаи новых приступов с резкой отменой. ¹⁹² Существуют противоречивые данные о том, снижает ли баклофен порог судорожной готовности.

Тизанидин является агонистом α-2, который относительно хорошо изучен для лечения спастичности при ЧМТ.Активация рецептора α-2 приводит к ингибированию высвобождения возбуждающих нейромедиаторов, таких как глутамат и аспартат, из-за отрицательной обратной связи. Общие побочные эффекты включают гипотонию и головокружение, но, что наиболее заметно и вызывает особую озабоченность у людей с травмой головного мозга, они также могут вызывать седативный эффект. Он также может вызвать повреждение печени, поэтому функциональные пробы печени следует проводить до начала лечения и снова через 1, 3 и 6 месяцев. Рандомизированное плацебо-контролируемое исследование изучало тизанидин в популяции пациентов с приобретенной травмой головного мозга.Первичным критерием оценки было изменение модифицированной шкалы Эшворта для сгибателей запястья через 6 недель. Тизанидин начинали с дозы 2 мг / день дважды в день и увеличивали до 36 мг / день, если переносимость переносилась. Статистической разницы в первичном исходе через 6 и 18 недель не было. ¹⁹³

Подобно тизанидину, клонидин также является агонистом α-2. Он действует как на голубое пятно, так и на уровне спинного мозга, усиливая пресинаптическое торможение на уровне спинного мозга.Он продемонстрировал некоторую эффективность в лечении спастичности, но в первую очередь у пациентов с травмами спинного мозга. ¹⁹⁴ Следует отметить, что существует опасение, что клонидин может ухудшить восстановление моторики после приобретенной травмы головного мозга. ¹⁹⁵

Дантролен — интересный выбор для лечения спастичности у пациентов с ЧМТ, поскольку его механизм действия — периферическое действие, поэтому он не вызывает седативного эффекта. Он действует, подавляя высвобождение кальция из саркоплазматического ретикулума, тем самым подавляя сокращение скелетных мышц.Его наиболее известный побочный эффект — гепатотоксичность. Функциональные пробы печени следует проверять еженедельно в течение первого месяца, а затем, по крайней мере, раз в два месяца в течение первого года.

Химический невролиз обычно используется для лечения спастичности, резистентной к пероральным препаратам. Химический невролиз особенно эффективен для лечения очаговой спастичности. Существует два основных агента химического невролиза — фенол и ботулотоксин. Фенол был первым нейролитическим средством, используемым для лечения спастичности.Он снижает спастичность за счет денатурирования белков моторных и сенсорных нервов, что приводит к снижению тонуса скелетных мышц. Его продолжительность действия обычно больше, чем у ботулотоксина. Типичная продолжительность действия составляет от трех до 9 месяцев, но может быть и дольше.

В отличие от фенола, ботулотоксин не влияет на чувствительные нервы. Ботулинический токсин был одобрен для использования в Соединенных Штатах в 1989 году. В настоящее время в США доступны два серотипа ботулинического токсина — типы A и B.Ботулинический токсин подавляет пресинаптическое высвобождение ацетилхолина из синаптических пузырьков. Комплекс растворимого рецептора белка прикрепления NSF (SNARE) прикрепляет синаптическую везикулу к клеточной мембране, тем самым позволяя высвобождать ацетилхолин в нервно-мышечное соединение. Ботулинический токсин серотипов A и B действует на различные комплексные белки SNARE. Тип A расщепляет растворимый белок прикрепления NSF-25 (SNAP-25), белок, прикрепленный к везикуле ацетилхолина, тогда как тип B расщепляет синаптобревин, белок, прикрепленный к клеточной мембране.Эффективность ботулотоксина для лечения спастичности была продемонстрирована в популяциях рассеянного склероза и ЧМТ. ^196,197

Возможны системные побочные эффекты ботулотоксина. Относительно легкие побочные эффекты включают головную боль, симптомы гриппа, усталость и тошноту. Более серьезные побочные эффекты включают угнетение дыхания, дисфагию и общую слабость. Ботулинический токсин серотипа B, по-видимому, имеет больше парасимпатических побочных эффектов, таких как сухость во рту и нарушение зрения. ¹⁹⁸

Баклофен для интратекального введения может также использоваться для лечения генерализованной спастичности. Баклофен для интратекального введения был впервые одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для использования в 1996 году. ¹⁹⁰ Преимущество системы интратекальной доставки состоит в том, что для адекватного контроля спастичности можно использовать гораздо более низкие дозы баклофена. С помощью интратекального насоса баклофен доставляется в субарахноидальное пространство спинного мозга. Хотя интратекальный баклофен может использоваться для лечения спастичности как верхних, так и нижних конечностей, он обычно более эффективен для лечения спастичности нижних конечностей из-за ограничений, касающихся размещения катетера высоко в шейном отделе позвоночника из-за сужения позвоночного канала.Перед имплантацией интратекальной баклофеновой помпы сначала проводится испытание, чтобы определить, есть ли у пациента адекватный ответ на интратекальный баклофен. Риски, связанные с интратекальной имплантацией баклофеновой помпы, включают инфекцию, отказ помпы, смещение или перекручивание катетера, а также утечку спинномозговой жидкости. В редких случаях отказ помпы или катетера может привести к отмене баклофена и связанным с этим судорогам.

Как упоминалось в начале этого раздела, следует проявлять осторожность, чтобы дифференцировать причину гипертонии, поскольку разные причины имеют разные стратегии лечения.Рефрактерная гипертония, несмотря на возрастающие дозы лекарств от спастичности, должна вызвать подозрение, что дистония может быть причиной гипертонии. Это особенно верно, если при осмотре отмечается зубчатое движение конечности с пассивным объемом движений. Сопротивление пассивному диапазону движений, не зависящему от скорости, предполагает наличие дистонии или паратонии. Вполне возможно, что гипертония может быть смешанной картиной спастичности, паратонии или дистонической ригидности. Это необходимо иметь в виду при оценке пациентов с гипертонией, поскольку парадигмы лечения для этих разных состояний различаются.(Таблица 11.16).

Границы | Гипервозбудимость позвоночника и измененная структура мышц способствуют гипертонусу мышц у новорожденных после дородовой гипоксии-ишемии у кроликов с церебральным параличом Модель

Введение

Детский церебральный паралич (ДЦП) — это синдром двигательной недостаточности, который возникает в результате повреждения развивающегося мозга с распространенностью 2,0–3,5 на 1000 живорождений (1). Церебральный паралич представляет собой «зонтичный» термин для расстройств с различными проявлениями моторного дефицита (2, 3) из-за неоднородных участков повреждения и различного времени повреждения, возникающего в раннем перинатальном периоде и влияющего на более позднее развитие (4–6).

Перинатальное повреждение головного мозга из-за гипоксии, ишемии и / или воспаления (7–9) обычно описывается как этиология ХП (1). Механизмы, способствующие двигательной дисфункции при ХП, остаются плохо изученными и, вероятно, включают изменения в нисходящем двигательном контроле, а также измененные схемы спинного мозга и внутренние свойства спинномозговых мотонейронов из-за аномального развития спинного мозга (3, 10).

Гипертонус мышц часто встречается при ХП и характеризуется повышенным сопротивлением движению в суставах (11).Моторный фенотип CP обычно связывают с синдромом верхних мотонейронов, возникающим в результате повреждения сенсомоторной коры или нисходящих проекций белого вещества (11–13). Положительные черты синдрома верхних мотонейронов часто рассматриваются как причина гиперрефлексии позвоночника, мышечной спастичности и совместных сокращений при ХП (3, 11). Спастичность и повышенная активность мотонейронов являются важными причинами гипертонии, но повышенный тонус также может быть связан с измененными пассивными тканевыми свойствами мышц и суставов или неспособностью расслабить мышцу до начала движения (3, 14).

Наиболее часто описываемые механизмы, которые, как считается, способствуют усилению активности моторных клеток при повреждении спинного мозга и ХП, — это снижение супраспинального ингибирующего синаптического входа (15), усиление возбуждающего синаптического входа из-за снижения ретракции первичных афферентов, происходящих при нормальном развитии и регулируемых нисходящим двигателем. проекции (10, 16–18), потеря сегментарных тормозных интернейронов (19), потеря рекуррентного торможения, опосредованного клетками Реншоу (20). Исследования на животных показывают, что повышенная собственная возбудимость мотонейронов после повреждения спинного мозга играет роль в ХП и может быть результатом изменений свойств мембранных метаботропных рецепторов (21) и переносчиков ионов, таких как переносчик хлорида калия [KCC2; (22)], а также морфологию мотонейронов сомы и дендритного дерева (23, 24).

Хотя все или некоторые из вышеперечисленных механизмов могут играть роль в ЦП человека, отсутствие животных моделей с явным двигательным дефицитом после нарушения развития препятствует их тестированию на клеточном и молекулярном уровне. Модель глобального антенатального гипоксически-ишемического (H-I) повреждения кролика отражает несколько характерных черт ХП человека, включая выраженный мышечный гипертонус, двигательный, постуральный и сенсорный дефициты у новорожденных кроликов (25, 26). Повреждение головного мозга белого и серого вещества в этой модели, приводящее к уменьшению нисходящих моторных проекций, может представлять собой механизм, который приводит к развитию моторного дефицита (27, 28).В текущем исследовании мы изучили несколько других механизмов, которые могут объяснить гипертонус мышц на модели кролика, а также структурные изменения мышц, вызванные травмой.

Поскольку большинство наборов новорожденных кроликов после антенатального глобального HI демонстрируют характерную позу в состоянии покоя, состоящую из чрезмерного сгибания в дистальных отделах передних конечностей и разгибания в дистальных суставах задних конечностей, оба из которых характерны для пациентов со спастическим ДЦП (12), мы сначала определили наличие постурального дефицита. были вызваны активным нейрональным компонентом, т.е.Т. е. усилением постоянной мышечной активности и дисбалансом между группами мышц сгибателей и разгибателей. Повышенная устойчивая мышечная активность в состоянии покоя может быть связана с усилением тонической разрядки мотонейронов без явной стимуляции. С другой стороны, постуральный дефицит можно объяснить структурными изменениями и изменением биомеханических свойств мышц и суставов (29).

Во-вторых, мы определили, связано ли повышенное сопротивление суставов у новорожденных кроликов после глобального антенатального повреждения H-I со спинальной гипервозбудимостью из-за снижения супраспинального пресинаптического торможения, что является механизмом, лежащим в основе спастичности при церебральном параличе (15, 30).Чтобы устранить этот механизм, мы измерили рефлекс Хоффмана (H-), электрический аналог рефлекса растяжения, во время нормального развития и после глобальной антенатальной травмы H-I. Аномальное увеличение H-волны и снижение темпозависимой депрессии (RDD) H-рефлекса объясняется снижением супрасегментарного торможения после травмы головного и спинного мозга (31), при этом аномалии также наблюдаются у детей с ХП (32, 33) .

Наконец, мы исследовали морфологические и биохимические свойства мотонейронов и глии (34), которые могут указывать на повышенную возбудимость и функциональную активность, такие как размер сомы и дендритного дерева (23, 24) и экспрессия транспортера KCC2 (35).

Методы

Исследование было одобрено институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию системы здравоохранения Университета Северного берега и проводилось в соответствии с Политикой службы общественного здравоохранения США в отношении гуманного ухода и использования лабораторных животных.

Модель животного

Хирургическая процедура была описана ранее (25). Новозеландские белые беременные кролики (Charles Rivers, Канада) в эмбриональный день (E) 25 (срок беременности 78%) перенесли стойкую ишемию матки, моделирующую острую плацентарную недостаточность при преждевременной беременности.Вкратце, самок анестезировали внутривенным введением фентанила (75 мкг / кг / час) и дроперидола (3,75 мг / кг / час) с последующей спинномозговой анестезией с использованием 0,75% бупивакаина. Баллонный катетер вводили в левую бедренную артерию и продвигали через нисходящую аорту выше матки и ниже почечных артерий. Баллон надували в течение 40 минут, вызывая ишемию матки и последующий глобальный H-I у плода. В конце H-I баллон был спущен, что привело к реперфузии матки и реперфузии-реоксигенации плода.Катетер был удален, бедренная артерия реконструирована, и дамба вернулась в ее клетку. Имитационные контрольные плотины подверглись той же хирургической процедуре, включая введение баллонного катетера, но без надувания баллона и не подверглись ишемии матки. Самкам разрешили родить в гнездовом ящике в срок (31,5 суток).

В послеродовой день 1 (P1) наборы прошли нейроповеденческое тестирование для определения степени моторного и сенсорного дефицита, включая измерения мышечного тонуса (25).Тонус оценивался по пассивному сгибанию и разгибанию передних и задних конечностей и оценивался по модифицированной шкале Эшворта относительно сопоставимых по возрасту контрольных групп в соответствующих конечностях: 1 — снижение тонуса / вялости, 2 — нормальный тонус, 3 — умеренное повышение тонуса, но конечность легко сгибается, 4 — конечность ригидна в сгибании или разгибании. Наборы для лечения гипертонуса (оценка мышечного тонуса> 2 по крайней мере на одной конечности) после H-I и наборы фиктивного контроля были выбраны для исследований. Наборы после H-I с нормальным мышечным тонусом или вялостью на P1 не были включены в это исследование.В анализ были включены один или два набора на помет.

Сразу после нейроповеденческого тестирования наборы были подвергнуты эвтаназии, а ткань спинного мозга была обработана для анализа, как описано ниже.

Оценка мышечного тонуса

Для оценки вклада активных (нейронных) и пассивных (из-за структурных изменений в мышцах и сухожилиях) компонентов в мышечный тонус, пассивное сопротивление суставов растяжению было оценено в лодыжках и коленях у подгруппы котят P1 с использованием специального лабораторного устройства, как описано подробно ранее (36).Количество наборов, использованных для измерения мышечного тонуса, составляло для голеностопного сустава n = 13, 9 и для колена n = 16, 7, контроль и гипоксия, соответственно. Суставы прикрепляли к вращающемуся зажиму и подвергали повторяющимся циклам сгибания и разгибания с максимальной амплитудой 40 градусов и частотой 0,8 Гц. Угол поворота и приложенная сила регистрировались с помощью датчиков. Первые 15 секунд растяжения не регистрировались, чтобы позволить животному адаптироваться к устройству и минимизировать произвольное мышечное сопротивление.Жесткость суставов, как мера мышечного тонуса, была получена из линейной регрессии кривых смещения-крутящего момента. После первоначального измерения наборы вводили внутримышечно. Кетамин 35 мг / кг и ксилазин 5 мг / кг, режим анестезии, обеспечивающий хирургический уровень анестезии, и через 25 минут было проведено второе измерение мышечного тонуса.

Определение архитектуры мышц

После умерщвления на Р1 с конечностей контрольных и гипертонических наборов ( n = 5, 4) снимали кожу и фиксировали в течение не менее 5 дней в 10% забуференном формалине в естественном расслабленном положении, сохраняя осанку / положение контрактур, если таковые имеются.Тыльные сгибатели голеностопного сустава — передняя большеберцовая мышца (ТА) и длинный разгибатель пальцев (EDL), а также подошвенные сгибатели голеностопного сустава — медиальная икроножная мышца (GM) и камбаловидная мышца были осторожно изолированы и удалены, промокнуты насухо и взвешены. Длину мышцы измеряли штангенциркулем как расстояние от начала самых проксимальных мышечных волокон до места прикрепления самых дистальных волокон. Пучки, состоящие из 5-15 волокон, отрывались от проксимальной, средней и дистальной области каждой мышцы. Длину пучка волокон (FL) измеряли в каждой области.Площадь физиологического поперечного сечения (PCSA) рассчитывалась согласно (37) с использованием мышечной массы, длины волокна и угла перистости. Пучки волокон замораживали и разрезали вдоль направления волокон на криостате. Двадцать микрометров срезов помещали на предметные стекла, окрашивали на H&E, а длину саркомера измеряли при 40-кратном увеличении. Подмножество задних конечностей подвергали поперечному сечению на криостате толщиной 20 мкм и обрабатывали с использованием набора для окрашивания трихромом (Masson) (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с производственным протоколом для оценки соединительной ткани.В этом препарате цитоплазма и мышечные волокна окрашиваются в красный цвет, тогда как соединительная ткань окрашивается в синий цвет.

Тестирование H-рефлекса и запись ЭМГ

Рефлекс Хоффмана был протестирован на P1, P5, P11, P18, P30 и взрослых контрольных кроликах ( n = 8, 4, 5, 3, 2, 2) и на P1 и P11 ( n = 5, 5) наборы для кроликов с гипертонусом мышц после антенатального ГИ. Животных слегка анестезировали кетамином (20 мг / кг). Чтобы свести к минимуму эффект хирургической процедуры, мы использовали метод записи, предложенный Хо и Уэйтом (38).Концентрический игольчатый биполярный электрод вводили чрескожно для стимуляции рострально-дистальной части плечевого сплетения вблизи лучевого / общего ствола медиального / локтевого нервов в передних конечностях (39) и в районе седалищного нерва в задних конечностях. Для записи проволочные электроды с тефлоновым покрытием диаметром 100 микрон и выступающим зазубренным концом 1 мм помещали в m. flexor carpi radialis передних конечностей и m. gastrocnemius в задних конечностях с помощью иглы для подкожных инъекций. Осуществляли стимуляцию нервов и регистрировали электромиографические (ЭМГ) ответы с использованием физиологического монитора (MP-150, Biopac, CA).Стимуляция состояла из биполярного прямоугольного импульса длительностью 0,2 мс, подаваемого через изолятор стимула. Отклик ЭМГ был усилен в 1000 раз и полосовой фильтром 1 Гц-5 кГц. Максимальное соотношение амплитуд H-волны и M-волны (H _max / M _max ) было измерено путем увеличения амплитуды импульса стимуляции от 0,05 до 1 В с шагом 0,05 В с 30 с между импульсами стимуляции. Эту последовательность повторяли 3 раза с 3-х минутным отдыхом между повторениями. Зависимая от скорости депрессия (RDD) H-рефлекса измерялась как отношение величин H-волны в контрольных и тестовых парах стимулов с амплитудами на уровне, позволяющем выявить максимальную величину H-волны, определенную в предыдущем эксперименте с линейным нарастанием.Пары контрольных и тестовых стимулов предъявлялись каждые 10 с с интервалами между стимулами 5, 2, 1, 0,5, 0,14, 0,03 с. Последовательность повторяли 3 раза с 3-минутным отдыхом между повторениями. У некоторых животных тестирование Н-рефлекса повторяли в разном возрасте. В конце выбранных конечных экспериментов был измерен H-рефлекс на обнаженном препарате нерва с последующим перерезанием нерва, чтобы подтвердить происхождение H-волны. Скорость нервной проводимости измерялась путем деления расстояния между стимулирующим и регистрирующим электродами на время от артефакта стимуляции и пика М-волны.

ЭМГ в покоящихся сгибателях и разгибателях задних конечностей регистрировали до измерения Н-рефлекса с настройками, описанными выше. В подгруппе экспериментов 2 набора проволочных электродов ЭМГ были вставлены в m. tibialis anterior и m. икроножная мышца. Запись проводилась в исходном состоянии мышц в состоянии покоя без движения конечностей до и через 10 мин после седации внутримышечно. инъекция смеси кетамина (35 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг). Среднеквадратическое значение сигнала ЭМГ было получено с временным окном для усреднения сигнала 0.03 с.

Маркировка сенсорных афферентных и моторных нейронов

Ретроградный нейрональный индикатор холерного токсина B (CTB), конъюгированный с флуорофорами Alexa Fluor 488 и 555 (Invitrogen, номер по каталогу C34775, C34776), вводили 3 мкл 0,02 мг / мл в группы мышц сгибателей и разгибателей запястий и лодыжек в точке P1 с использованием системы Гамильтона. шприц. Инъекция была сделана в 3 места для группы мышц, чтобы расширить охват маркировки. Для экспериментов по отслеживанию использовали семь контрольных и 11 гипертонических наборов. Через два дня после инъекции индикатора животным проводили транскардиальную перфузию 4% -ным раствором параформальдегида, спинной мозг извлекали, фиксировали, подвергали криопротекции 30% -ной сахарозой и замораживали на сухом льду.Последовательные срезы расширений шейного и поясничного отделов спинного мозга толщиной 40 мкм на расстоянии 400 мкм вырезали на криостате и помещали на предметные стекла, покрытые полилизином (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Срезы визуализировали под микроскопом (Leica Microsystems, Ветцлер, Германия), прикрепленным к моторизованному столику (Ludl Electronic Products, Хоторн, Нью-Йорк). Фотографии меченых мотонейронов, по крайней мере, 20 нейронов в каждой области, были сделаны при 40-кратном увеличении на глубине фокуса, где площадь поперечного сечения мотонейронов была наибольшей.Границы сомы нейронов отслеживали вручную с помощью программного обеспечения ImageJ, рассчитывали площадь помеченной сомы мотонейронов и сообщали в качестве прокси для размера сомы мотонейронов. Кроме того, чтобы выявить соматотопную организацию и спинномозговую локализацию, маркировку CTB проводили на отдельной когорте контрольных наборов ( n = 6) путем инъекции трассеров CTB разного цвета в проксимальном (плечо, бедро) и дистальном (локоть, локоть, локоть). голеностопного сустава) группы мышц, сгибатели и разгибатели отдельно. Ростро-каудальное и медиолатеральное распределение меченых мотонейронов регистрировали на систематических серийных срезах относительно сегментарных нервов и анатомических ориентиров позвоночника.

Для оценки общей длины меченых первичных афферентных волокон в спинном мозге мы использовали сферический зонд в программе Stereo-Investigator (MBF Bioscience, Williston, VT, USA). CTB-меченные первичные афференты, образующие характерные пятна в дорсальном роге и в промежуточных CTB-меченных волокнах, подсчитывались в шейных и поясничных расширениях, где присутствовала маркировка, для каждого набора на пяти 40-мкм коронковых срезах, расположенных на расстоянии 200 мкм друг от друга. Использовалась сетка отбора проб 100 × 100 мкм ² .Для всех образцов виртуальная сфера поддерживалась с радиусом 10 мкм, а защитные зоны составляли 2 мкм. Контуры были нарисованы при 10-кратном увеличении вокруг помеченных областей в спинном роге и промежуточной зоне отдельно, и подсчет проводился при 40-кратном увеличении. Длину волокон, меченных CTB, в объеме 1 мкм ³ в спинном мозге рассчитывали путем деления общей расчетной длины на общий измеренный объем.

Пятно Гольджи и морфологический анализ моторных нейронов

по Гольджи – Коксу проводили на свежих срезах расширений шейного и поясничного отделов спинного мозга толщиной 150 мкм с использованием набора FD Rapid Golgi Stain Kit (FD NeuroTechnologies, США) в соответствии с протоколом производителя.Было измерено 40 хорошо индивидуализированных (8 клеток от 5 животных в группе), хорошо пропитанных нейронов ромбовидной формы и некоторого размера> 20 мкм, без фрагментации окрашивания, и большая часть дендритного поля, по-видимому, ограничена одним участком. для каждой из областей расположения моторных нейронов, проецируемых на дистальные группы мышц [как определено с помощью CTB-трассировки, описанной выше, и в соответствии с предыдущими анатомическими исследованиями на кроликах (40)]. Стек срезов, покрывающих дендритное дерево на всем срезе, был захвачен (объектив с 20-кратным увеличением) с интервалами 1 мкм, а проекционное изображение максимальной интенсивности было получено из набора изображений с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices, США).Дендриты каждого выбранного нейрона отслеживали вручную, а степень и распределение дендритных ветвлений этих нейронов оценивали с помощью анализа Шолля (метод концентрических кругов) с использованием программного обеспечения ImageJ (http://imagej.net/Sholl). Рассчитывали общую длину дендритов, среднее количество пересечений на расстоянии 200 микрон от тела клетки и индекс ветвления (показатель ветвления, соотношение между максимальным количеством пересечений и количеством первичных ветвей).

Иммуноокрашивание и стереологическая оценка глиоза спинного мозга

Контрольные наборы кроликов P1 для новорожденных ( n = 6) и с гипертонусом ( n = 6) после H-I анестезировали смесью кетамин-ксилазин и транскардиально перфузировали 0.1 M PBS, а затем 4% параформальдегид в 0,1 M PBS. Спинной мозг удаляли, затем фиксировали в том же фиксаторе не менее 24 часов, подвергали криопротекции 30% сахарозой и замораживали. Последовательные срезы толщиной 40 мкм вырезали с интервалами 400 мкм на криостате из шейных (C4 – C8) и поясничных расширений (L4 – L7) и помещали на предметные стекла, покрытые полилизином (Sigma Aldrich, США), и сушили на воздухе. Извлечение антигена проводили путем нагревания образцов в 10 мМ цитрате натрия, pH 6,0, при 95 ° C в течение 15 мин. Срезы блокировали 5% козьей сывороткой с последующей инкубацией с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C и биотинилированным вторичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим нанесением комплекса авидин-биотин (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA. ) на 1 час.Цвет проявлялся с использованием 3,3′-диаминобензидина (Sigma Aldrich, Миссури, США).

Для иммуноокрашивания астроглии первичными антителами были куриные поликлональные антитела против GFAP (Abcam ab 4674, 1: 200). Вторичные антитела представляли собой козий анти-куриный IgG (ВА-9010, 1: 200; Vector Laboratories). Для иммуноокрашивания микроглии первичными антителами были козьи анти-Iba-1 (1: 500, Abcam ab5076). Вторичные антитела были ослиными против козьих (1: 200; Abcam ab6884).

Астроглия в спинном мозге при окрашивании GFAP представляет собой в основном глиальные отростки с небольшим количеством клеточных тел.Сферические шариковые зонды использовались для оценки общей длины GFAP-положительных волокон в Stereo-Investigator. Контуры белого и серого вещества были очерчены на срезах под объективом с 5-кратным увеличением в качестве эталонного пространства, а волокна подсчитывались под объективом с 40-кратным увеличением. Использовалась сетка отбора проб 250 × 250 мкм ² . Для всех образцов виртуальная сфера поддерживалась с радиусом 10 мкм, а защитные зоны составляли 2 мкм. Длину GFAP-положительных волокон в объеме 1 мкм ³ в спинном мозге рассчитывали путем деления общей расчетной длины на общий измеренный объем.

Количество Iba-1-положительных клеток определяли количественно в шейном и поясничном отделах спинного мозга с использованием зонда оптического фракционатора в StereoInvestigator. Контуры белого и серого вещества были очерчены на секциях под объективом 5x в качестве эталонного пространства. Подсчет клеток производился под объективом 10x с сеткой счета 150 × 150 мкм ² , сеткой выборки 400 × 400 мкм ² . Коэффициент ошибки Гундерсена стереологической оценки для каждого животного составлял от 0,05 до 0.12. Плотность Iba-1-положительных клеток рассчитывали как общее расчетное количество клеток, деленное на измеренный объем.

ПЦР в реальном времени

наборов из контрольной группы и группы с гипертонией ( n = 5 из 2 пометов, 5 из 4 пометов, соответственно) были умерщвлены на Р1. Шейный и поясничный связки были быстро собраны и сохранены в растворе RNAlater (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Последовательность-мишень ПЦР переносчика KCC2 кролика была основана на общей части выравнивания последовательностей переносчика KCC2 человека (NM_000868), мышей (NM_008312) и крысы (NM_012765), прямой праймер: 5′-GCT TCT ACT TGG GCA CTA CC-3 ‘, и обратный праймер, 5’-CCA TAG CTG GGA AGA GGT AAG-3 ‘, зонд ACA TCC TGG GCA CCA TCG AAA TCC.Затем последовательность была отправлена ​​на веб-сайт Applied Biosystems для заказа изготовленных на заказ праймера Taqman и набора зондов. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора кДНК ОТ с высокой емкостью (ABI). ПЦР в реальном времени проводились на машине ABI StepOne с программой по умолчанию. 18s рРНК использовали в качестве внутреннего контроля. Представлены значения относительной количественной оценки (RQ).

Вестерн-блоттинг

образцов пуповины были получены из контрольного и гипертонического наборов ( n = 6, 5) на P1. Для построения профиля развития использовали 5 контрольных наборов для получения образцов пуповины в каждом возрасте на E26, P1, P5, P11, P18, P25 и взрослых.Содержание KCC2 определяли вестерн-блоттингом с использованием мышиных моноклональных антител (MAB8369, R&D, США, разведение 1: 500). Образцы тканей гомогенизировали в ледяном буфере для лизиса 1x RIPA. Равное количество белкового лизата подвергали электрофорезу в SDS-PAGE с использованием готовых гелей Bio-Rad Criterion ™ XT 4012% Bis-Tris (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния) и переносили на PVDF-мембраны с использованием полусухого переноса. система (Bio-Rad). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком с 0,1% Tween-20 в течение часа на шейкере при комнатной температуре, а затем зондировали первичными антителами в 5% NFM в TBST в течение ночи при 4 ° C, а затем инкубировали со вторичными антителами в течение 1 часа. при комнатной температуре.Оптическая плотность каждой полосы на блоте была количественно определена с помощью ImageJ (NIH, Bethesda, MD), нормализована к GAPDH и представлена ​​как кратное изменение относительно контрольной ткани.

Статистика

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравнение между H-I и контрольными группами было выполнено с помощью теста t- с соответствующими поправками для множественных сравнений. Сравнение возрастных групп проводилось с помощью однофакторного дисперсионного анализа. ANOVA с повторными измерениями с последующей коррекцией post-hoc для процедуры множественных сравнений использовались в зависимости от скорости депрессии H-рефлекса.

Результаты

Гипертонус мышц у новорожденных после дородового H-I с активным и пассивным компонентами

Первоначальное распределение групп по гипертоническим и негипертоническим комплектам было основано на ручном подсчете. Мы проверили, соответствует ли повышенный мышечный тонус, воспринимаемый исследователем (25), лабораторным измерениям пассивного сопротивления суставов. Пассивное сопротивление суставов в наборах P1 оценивалось по компоненту жесткости реакции крутящего момента-смещения и было выше в гипертонической группе, чем в негипертонической фиктивной контрольной группе (рис. 1А).После введения анестетика кетамином / ксилазином, в результате чего наборы стали вялыми и невосприимчивыми к защемлению, жесткость суставов снизилась до <0,05 г / см / градус в негипертонической группе. Жесткость суставов в гипертонической группе после анестезии не достигла уровня жесткости негипертонической группы, что указывает на наличие пассивного компонента в повышении мышечного тонуса после антенатального H-I. Дельта-изменение жесткости до и после анестезии в группах голеностопных суставов не различалось, но было больше в коленях гипертонических комплектов (рис. 1В), что указывает на наличие активного компонента мышечного гипертонуса.Жесткость отдельных животных в коленных и голеностопных суставах до и после введения анестетика представлена ​​на рисунках 1C, D. Было некоторое совпадение значений жесткости между гипертонической и контрольной группами, вероятно, из-за неполного расслабления в некоторых наборах и остаточного присутствия активного мышечного сопротивления. График демонстрирует, что животные с большей жесткостью в коленях имеют большее снижение жесткости после анестезии.

Рисунок 1 . Оценка пассивных и активных компонентов повышения мышечного тонуса в наборах после антенатального H-I.Мышечный тонус оценивали с помощью пассивной растяжки суставов. Абсолютное (A) и дельта-изменение (B) жесткости сустава рассчитывается до и после анестезии в наборах P1 с гипертонией и без нее. Жесткость суставов отдельных животных перед анестезией в голеностопных суставах (C) и коленях (D) нанесена на горизонтальные оси, а после анестезии — на вертикальные оси. Пунктирная линия представляет собой линию идентичности. (E) Электромиограмма разгибателей голеностопного сустава (m. Gastrocnemius, GM) и сгибателей (m.tibialis anterior, TA) в период без движения конечностей, зарегистрированный с помощью внутримышечных электродов с колючей проволокой. Кривая ЭМГ показана у кролика с гипертонусом P1 до и после анестезии (указано стрелкой) кетамином / ксилазином. (F) Среднеквадратичное значение ЭМГ (F) уменьшилось при анестезии при TA и GM. Не было обнаружено различий между контрольной и гипертонической группами до и после анестезии.

Для определения вклада исходной активности мышц в состоянии покоя (при отсутствии активных мышечных сокращений) в повышенное сопротивление суставов и постуральный дефицит регистрировали ЭМГ в мышцах сгибателях и разгибателях голеностопного сустава до и через 10 минут после анестезии кетамином / ксилазином.Анестезия вызвала уменьшение амплитуды ЭМГ в контрольных и гипертонических наборах, как видно на графике ЭМГ на рисунке 1E. Никакой разницы между контрольным и гипертоническим наборами не было обнаружено в средних RMS EMG до, а также после анестезии (рис. 1F), что указывает на то, что нейронный компонент мышечной активности присутствует в гипертонических наборах, но не увеличивается по сравнению с контролем, и что Повышение сопротивления суставов в гипертонических комплектах нельзя объяснить постоянной активацией мышц или одновременным сокращением сгибателей и разгибателей.

Архитектура мышц

Hypertonic демонстрируют выраженную атрофию мышц конечностей, о чем свидетельствует значительное сокращение мышц и уменьшение мышечной массы (Рисунки 2A, B). Длина мышечных волокон и физиологическая площадь поперечного сечения также были уменьшены в большинстве мышц (рисунки 2C, D), как агонистов, так и антагонистов. Серийное число саркомеров было значительно ниже во всех исследованных мышцах у животных с гипертонусом (рис. 2E). Длина саркомера в ТА-мышцах была значительно больше (рис. 2F).Примечательно, что гипертонические комплекты часто демонстрируют преувеличенное постоянное сгибание подошвы, соответствующее уменьшенному серийному числу саркомеров и увеличению длины саркомера ТА. Мы также окрашивали мышцы конечностей на предмет содержания соединительной ткани, чтобы понять повышенное пассивное сопротивление суставов у пораженных наборов. Визуальный осмотр мышц, окрашенных трихромом по Массону, не выявил явных различий в содержании внеклеточного матрикса (синий цвет на фиг. 2G, H) между контрольным и гипертоническим наборами.

Рисунок 2 .Свойства мышц в контрольных и гипертонических наборах после антенатального HI: длина мышцы (A) , влажная масса мышц (B) , физиологическая площадь поперечного сечения (PCSA, C ), длина мышечных волокон (D) , количество саркомеров (E) и длина саркомера (F) . Задние конечности фиксировали в нейтральном положении и отсекали. Окрашивание трихромом по Массону на мышцах голеностопного сустава в контрольных наборах (G) и гипертонических (H) P1, поперечный разрез конечности: красные — мышечные волокна, синий — коллаген и кость.ТА, м. передняя большеберцовая мышца; EDL, м. длинный разгибатель пальцев; GM, m.gastrocnemius medius. Шкала на (G, H) 500 мкм. * p <0,05.

Изменения созревания H-рефлекса при нормальном развитии кролика и после антенатального H-I

Мы смогли вызвать H-рефлекс у 75% животных на передних конечностях и 62% на задних конечностях в точке P1, и почти во всех наборах в более позднем возрасте. Типичные следы ответов на нервную стимуляцию в передних и задних конечностях показаны на рисунке 3А.Стимуляция нервов деполяризует сенсорные и двигательные волокна смешанных нервов в двух направлениях, что приводит к появлению на ЭМГ волн двух типов: М-ответ (прямая активация мышц) и Н-рефлекс (центральный петлевой путь). H-волны с более длительным латентным периодом исчезли после перерезки нерва проксимальнее места стимуляции (стрелки на рисунке 3A), что подтверждает спинномозговое происхождение H-волны. В то время как амплитуда M-волны постепенно увеличивалась с увеличением тока стимуляции, пока не достигла плато, H-волна достигла максимальной амплитуды, а затем уменьшалась с дальнейшим увеличением интенсивности стимуляции (Рисунок 3B).Отношение Hmax / Mmax увеличивалось с гипертонусом в передних конечностях ( p = 0,032) и задних конечностях ( p = 0,041) на P1, но не на P11 (Рисунок 3C). Скорость проводимости по периферическим нервам постепенно увеличивалась по мере развития как передних, так и задних конечностей с быстрым увеличением после P11 (Рисунок 3D). Разницы в скорости нервной проводимости между контрольной группой и группой с гипертонией не обнаружено.

Рисунок 3 . Оценка моносинаптического H-рефлекса в развитии и после дородовой травмы H-I. (A) Репрезентативные записи ЭМГ нервной стимуляции передних и задних конечностей на кроличьих наборах P1 и P11. Ответ состоял из M-волны с более короткой задержкой и H-волны с большей задержкой. Н-волна исчезла после перерезки нерва (стрелки) проксимальнее стимулирующего электрода. Калибровочные стержни 0,5 В / 10 мс. (B) Типичная кривая «стимуляция-ответ» H-рефлекса, записанная на передних конечностях контрольного кролика P5. Определяли максимумы H- и M-волн и соотношение Hmax / Mmax. (C) Hmax / Mmax увеличивается с возрастом до P30 как в передних, так и в задних конечностях при нормальном развитии. Hmax / Mmax значительно увеличивалось при гипертонии на P1, но не на P11. (D) Скорость проводимости увеличивалась с возрастом, но не изменялась у гипертонических животных. * p <0,05.

В тесте зависимой от частоты депрессии (RDD) величина тестового импульса уменьшалась с более короткими интервалами между парными контрольными и тестовыми импульсами стимуляции.Не было существенной разницы в RDD во время нормального постнатального развития в тестируемых возрастах между P1 и P30 ни в передних, ни в задних конечностях (рис. 4A, B, планки погрешностей не показаны для ясности). Также не было значительных различий в RDD между передними и задними конечностями при нормальном развитии в соответствующем возрасте. Значительное снижение RDD было обнаружено в гипертонических наборах после H-I, в P1 и P11, с интервалами между стимулами 1 с и менее, как в передних конечностях (Рисунок 4C), так и в задних конечностях (Рисунок 4D).

Рис. 4. (A) Зависимая от скорости депрессия H-рефлекса при нормальном развитии и после антенатального H-I. Нет разницы в темпозависимом угнетении Н-рефлекса с развитием. (B) Нет разницы в RDD между передними и задними конечностями для соответствующего возраста. (C) Снижение RDD в гипертонических наборах после H-I в передних конечностях в точках P1 и P1. (D) Снижение RDD в гипертонических наборах после H-I в задних конечностях в точках P1 и P1. * p <0.05 для P1, # p <0,05 для P11.

Морфология мотонейронов и плотность первичных афферентных волокон не изменяются после антенатального введения H-I

Для определения местоположения спинномозговых мотонейронов, выступающих в дистальные группы мышц, где мышечный гипертонус обычно наблюдается у пораженных кроликов после антенатального H-I, было проведено мечение с помощью инъекции ретроградного нейронального индикатора CTB в соответствующие группы мышц передних и задних конечностей. Пространственное распределение меченых мотонейронов относительно сегментов позвоночника показано для передних конечностей на рисунке 5A и для задних конечностей на рисунке 5B.Расположение и пространственное распределение мотонейронов в целом согласуется с ранее описанным картированием задних конечностей кроликов (40). Мотонейроны, выступающие к мышцам локтя и запястья, надежно обнаруживались между сегментами C6 и C8, а мотонейроны, выступающие к бедру и лодыжке, — между L6 / L7 и S1. Нейроны мышц-сгибателей были обнаружены более дорсо-медиально по сравнению с разгибателями, а нейроны проксимальных мышц — более медиально по сравнению с дистальными. Хотя наблюдалась общая соматотопия (41), между пулами наблюдалось большое перекрытие (рисунки 5A, B).Поэтому отдельный анализ сгибателей / разгибателей и разных суставов не проводился. Мотонейроны в идентифицированных местах для передних и задних конечностей отслеживали при окрашивании по Гольджи (Фигуры 5C, D), а записи количественно оценивали при помощи анализа Шолля. Гипертонические группы имели меньшую длину дендритного дерева [ F _{(1, 76)} = 5,92, p = 0,017] и индекс ветвления [ F _{(1, 76)} = 20,4, p <0,001] , но post-hoc сравнения выявили значительные различия между группами для соответствующих регионов только по индексу ветвления (рисунки 5E, F).

Рисунок 5 . Картирование соматотопных мотонейронов и размеры дендритных деревьев в мотонейронах при окрашивании по Гольджи. (A, B) Расположение нейронов, меченных ретроградным токсином холеры, из дистальных и проксимальных групп мышц на поперечных срезах спинного мозга в шейном отделе (A) и поясничном расширении (B) . Расположение двигательных нейронов, выступающих в дистальные и проксимальные (запястье и локоть в передних конечностях, лодыжка и колено в задних конечностях) мышцы, обозначено заштрихованными и закрашенными кружками, соответственно, сгибатели и разгибатели — пустыми и темными кружками соответственно.Моторные нейроны, окрашенные по Гольджи, фотографировали при 10-кратном увеличении в виде стопки и получали проекцию максимальной интенсивности (C) . Индивидуальные нейроны были отслежены (D) . Анализ Шолля был проведен для оценки длины дендритного дерева (E) и индекса ветвления (F) .

Типичная маркировка тел мотонейронов и первичных сенсорных афферентов от дистальных мышц показана на рисунках 6A – C. Размер сомы мотонейронов в шейном канатике был значительно меньше, чем в поясничном в контрольных наборах P1, 183.1 ± 22,8 против 237,1 ± 7,3 мкм ² , p = 0,026). Мотонейроны, меченные инъекцией CTB в группу мышц-сгибателей, были расположены более медиально от нейронов, меченных инъекцией в мышцы-разгибатели, со значительным пространственным перекрытием между моторными пулами (рис. 6А). Не было обнаружено различий в размере сомы между контрольной и гипертонической группами в мотонейронах, иннервирующих дистальные мышцы-сгибатели или разгибатели шейного или поясничного отдела спинного мозга (рисунки 6D, E). Не было обнаружено явных различий в распределении размеров сомы между контрольной и гипертонической группами (рисунки 6F, G).

Рисунок 6 . Мечение моторных нейронов и первичных афферентов путем внутримышечной инъекции CTB в наборах для новорожденных. Ретроградный нейрональный индикатор холерного токсина В, конъюгированный с флуорофорами разного цвета (оранжевый и зеленый), вводили в группы мышц-сгибателей и разгибателей запястья и голеностопного сустава в наборах P1, а шнуры собирали через 2 дня. (A) Меченые двигательные нейроны вентрального рога шейного отдела спинного мозга. Оранжевая метка — от сгибателей запястья, а зеленая — от инъекции в разгибатели запястья.Стереологическая оценка размера сомы мотонейрона находится на (D, E) и распределении размеров (F, G) . Мечение первичных афферентов в спинном роге (B) и промежуточной зоне (C) и стереологическая оценка плотности волокон (H, I) . На вставках в (A – C) показаны схемы спинного мозга, указывающие места, где были сделаны снимки с большим увеличением.

Первичная сенсорная афферентная маркировка от мышечной инъекции CTB была сосредоточена в двух участках, в области желатинового вещества заднего рога и в промежуточной зоне (Фигуры 6B, C).Первичная афферентная плотность оценивалась отдельно в этих областях. Не было значительной разницы в плотности первичных афферентных волокон между контрольным и гипертоническим наборами (рисунки 6H, I).

Изменения в транспортере хлорида калия KCC2 не связаны с гипертонией после дородового введения H-I

Чтобы проверить, играет ли транспортер хлорида калия KCC2 роль в моторных дефицитах у пораженных кроликов после антенатального H-I, мы сначала исследовали изменения в развитии KCC2. Первоначально низкое содержание белка KCC2 у неопытного плода кролика увеличивалось в шесть раз после рождения, достигало максимума около P5 – P11, а затем снижалось по мере созревания и достигало плато после P11 – P18 (Рисунок 7A).Снижение KCC2 в шейном канатике происходило быстрее, чем в поясничном отделе, но содержание KCC2 не различалось между расширениями шейного отдела поясничного отдела у взрослых кроликов. Экспрессия гена KCC2 с помощью ОТ-ПЦР была ниже в наборах для гипертонии на P1 в шейном ( p = 0,001) и поясничном ( p = 0,018) (рис. 7B), но содержание белка не отличалось между контролем и гипертонией. группы либо в шейном, либо в поясничном пуповине, измеренные с помощью вестерн-блоттинга (Рисунок 7C).

Рисунок 7 .Экспрессия транспортера хлорида калия KCC2 при нормальном развитии и после антенатального повреждения H-I. (A) Экспрессия белка KCC2 во время развития от эмбрионального до взрослого возраста в шейном и поясничном отделах спинного мозга, количественно определенная оптической плотностью полосы KCC2 относительно домашнего белка GAPDH на Вестерн-блоттинге. (B) Относительная экспрессия гена KCC2 у контрольных кроликов и кроликов с гипертонической болезнью P1 при ОТ-ПЦР. (C) Вестерн-блоттинг KCC2 у контрольных и гипертонических кроликов P1. * p <0.05.

Повышенная плотность волокон астроглии и активированная микроглия в спинномозговом сером веществе с гипертонией

Астроглия проявлялась при окрашивании GFAP в спинном мозге как преимущественно волокна с несколькими клеточными телами (Рисунки 8A, B). Плотность GFAP-положительных волокон была значительно выше в сером веществе в гипертонических наборах в поясничном отделе спинного мозга ( p = 0,014), но не различалась в белом веществе между группами (рисунки 8C, D). Астроглиоз был более выражен в вентральных рогах гипертонических наборов.

Рисунок 8 . Астроглиоз и повышенная плотность микроглии в сером веществе спинного мозга после дородовой травмы H-I. (A, B) Типичное окрашивание GFAP в шейном канатике контрольных наборов (A) и гипертонических (B) . Вставки в верхнем левом углу показывают глиальные волокна при большем увеличении. Значительное увеличение плотности глиальных волокон в сером веществе (C) , но не в белом веществе (D) обнаружено при стереологической количественной оценке длины положительных волокон GFAP. (E, F) Типичное окрашивание Iba-1 в шейном канатике контрольных наборов (E) и гипертонических наборов (F) . На вставках вверху слева показаны микроглиальные клетки при большем увеличении. Обратите внимание на утолщенные клеточные тела и укороченные процессированные, что свидетельствует об активированной морфологии микроглии, обнаруженной как у гипертонических, так и у контрольных животных. Значительное увеличение количества Iba-1-положительных клеток в сером веществе (G) , но не в белом веществе (H) при стереологической количественной оценке плотности Iba-1-положительных клеток.* p <0,05.

Iba-1-положительная микроглия в контроле, а также в гипертонических наборах, спинной мозг имел преимущественно круглую и амебовидную форму с короткими толстыми отростками (рис. 8E, F), типичными для раннего постнатального периода (42) и напоминал морфологический вид активированной микроглии в у старых животных, в отличие от покоящейся разветвленной микроглии у взрослых (43). В обеих группах было обнаружено очень мало высокоразветвленных положительных по Iba-1 клеток; поэтому по стереологии оценивали только общее количество Iba-1-положительных клеток.Количество Iba-1-положительных клеток было значительно выше в группе с гипертонусом как в шейном, так и в поясничном сером веществе пуповины (Рисунки 8G, H) (p-val = 0,023).

Обсуждение

В текущем исследовании мы изучили несколько механизмов, которые могут способствовать повышению мышечного тонуса у новорожденных кроликов после глобального антенатального H-I. Основные результаты можно резюмировать следующим образом: в то время как доказательства снижения супраспинального тормозного контроля и повышенной возбудимости при моносинаптическом спинальном рефлексе были обнаружены снижением зависимой от скорости депрессии и повышением Hmax / Mmax в H-рефлексе, были объяснены аномальная осанка и повышенное сопротивление суставов растяжению. первичными биомеханическими изменениями мышц и суставов.

Гипервозбудимость позвоночной сети

Моносинаптический рефлекс Гофмана считается основным зондом для неинвазивного исследования сенсомоторной интеграции в спинном мозге человека и животных (44). Отношение максимальных амплитуд волн H и M обычно используется как показатель периферической рефлекторной возбудимости (45). Хотя состояние возбудимости пула α-мотонейронов играет важную роль в определении величины H-рефлекса (46, 47), оно также зависит от множества пре- и постсинаптических тормозных механизмов (31).Сообщалось о повышенной возбудимости моносинаптического пути H-рефлекса у детей с церебральным параличом (33) с положительной корреляцией между отношениями Hmax / Mmax и модифицированной шкалой Эшворта. Было обнаружено, что латентный период H-волны был короче, а соотношение амплитуд Hmax / Mmax было выше у детей со спастичностью по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы. Используя зависимость H-рефлекса от частоты стимуляции, можно сделать вывод о нисходящем пресинаптическом торможении (48). Заметное снижение RDD H-рефлекса наблюдалось у детей со спастичностью и атетозом, но не с атаксией, изучалось у новорожденных детей в возрасте до 9 лет, по сравнению с типично развивающимися детьми (32).

В нашем исследовании мы обнаружили значительные изменения свойств H-рефлекса после антенатального H-I. Повышение отношения Hmax / Mmax и снижение RDD в наборах для кроликов с гипертонической болезнью были аналогичны изменениям H-рефлекса, наблюдаемым у животных с аблацией кортикоспинального входа в неонатальном периоде с использованием хирургических или генетических методов (20, 49), а также у людей со спастическим или дистоническим синдромом. типы ЦП (32, 33). Снижение RDD в гипертонических наборах предполагает снижение супраспинального ингибиторного контроля, что может быть опосредовано потерей нисходящих двигательных проекций после фетального H-I (27, 28).Повышение Hmax / Mmax у новорожденных кроликов с гипертонией может также указывать на то, что более сильные афферентные синаптические связи сохраняются в гипертонических наборах из-за травмы или задержки поступления кортикоспинальных проекций (10), но мы не нашли доказательств этого на основе количественной оценки плотности сенсорных афферентов. . Последующее снижение Hmax / Mmax, наблюдаемое в более позднем возрасте в гипертонических наборах, может указывать на продолжающуюся дегенерацию спинномозговой цепи.

В этом исследовании мы охарактеризовали развитие H-рефлекса у кроликов от раннего неонатального периода до взрослого возраста.В то время как сообщения о свойствах H-рефлекса в задних конечностях крыс многочисленны, особенно на моделях повреждений спинного мозга, характеристика H-рефлекса редко или ограничена в условиях развития, в передних конечностях (50) и у кроликов (51). По нашему опыту, H-рефлекс было легче зарегистрировать на передних конечностях у новорожденного на точке P1, что свидетельствует о более быстром развитии передних конечностей, чем задних. Хотя Hmax / Mmax увеличивалось с возрастом, в соответствии с предыдущими сообщениями у людей, не было обнаружено значительных различий между передними и задними конечностями в Hmax / Mmax и RDD в развитии.У типично развивающихся детей RDD была меньше у младенцев в возрасте от 0 до 12 месяцев по сравнению с детьми в возрасте 1–9 лет, особенно при интервалах между стимулами от 100 до 800 мс (32), и это было связано с незрелым супраспинальным тормозным контролем.

Изменения скелетных мышц

Чтобы определить, приводит ли повышенная возбудимость спинномозговых нейронов к повышенной мышечной активности, потенциально объясняющей характерную осанку и повышенное сопротивление суставов у пораженных кроликов, мы количественно оценили жесткость суставов и ЭМГ до и после введения анестетика.Жесткость суставов в гипертонической группе снизилась после введения анестетика примерно на ту же величину, что и в контрольной группе, в лодыжках и немного больше в коленях. Не было изменений в исходном объеме спинного мозга в состоянии покоя до и после введения анестетика (на что указывает RMS EMG в мышце покоя), параметр, который часто выбирают, потому что он отражает уровень активности двигательных единиц (52). Эти наблюдения показывают, что повышенное сопротивление суставов в гипертонических наборах, вероятно, объясняется изменениями биомеханических свойств мышц и суставов.В гипертонических наборах мы обнаружили уменьшение физиологической площади поперечного сечения, укорочение мышц, уменьшение серийного числа саркомеров и увеличение длины саркомеров в некоторых мышцах. Важно отметить, что эти изменения наблюдаются у пациентов с ХП человека (3, 53) и животных после деафферентации новорожденных на мотонейроны позвоночника (54). Мы не обнаружили увеличения соединительной ткани, как это наблюдается в спастических мышцах ЦП человека (55, 56), но это может быть объяснено исследованным возрастом (новорожденные P1) и может развиться в более позднем возрасте как адаптация мышц к увеличению растяжения.

У людей-подростков с ХП как жесткость ткани, представляющая ненейронный компонент, так и рефлекторный момент, представляющий нервный вклад в жесткость суставов, были значительно увеличены при количественном тестировании голеностопного сустава и были пропорциональны клинической оценке двигательных нарушений (57). На модели кролика возможно, что повышенная активность спинномозговых мотонейронов и мышц может происходить на более ранних стадиях повреждения в утробе матери с последующей дегенерацией нейронов и не наблюдается постнатально.Укорочение мышц может происходить вторично по отношению к гипертону и приводить к образованию контрактуры, которая возникает при росте длинных костей. Недавнее наблюдение, что популяция мышечных стволовых клеток у детей с ХП снижается, также согласуется с этой гипотезой (58, 59).

Наблюдения за ХП человека представили доказательства замедления скорости проводимости у детей со спастическим ХП (60), подразумевая, что аномалии миелинизации могут возникать на ранних стадиях ХП и сохраняться в зрелом возрасте. В нашем исследовании скорость проводимости периферических нервов увеличивалась с возрастом в контрольной группе, но не отличалась от гипертонических наборов на P1 и P11.Хотя мы не изучали скорость периферической проводимости до полного созревания, неизменная скорость проводимости нерва на P11, когда седалищный и срединный нервы уже в значительной степени миелинизированы у кроликов, указывает на то, что гипертония в модели кролика вызвана повреждением центральной нервной системы, а не периферический.

Морфологические изменения, которые могут способствовать внутренним и синаптическим свойствам мотонейронов

Высокое входное сопротивление и низкая емкость незрелых мотонейронов из-за меньшего размера, менее развитого ветвления дендритов и более низкой плотности каналов по сравнению со взрослыми, были связаны с повышенной возбудимостью в покое (61, 62).В то время как при нормальном развитии зависимое от активности увеличение размера сомы и ветвление дендритов приводит к снижению возбудимости мотонейронов, перинатальное повреждение может задерживать созревание пассивных свойств мембраны. Это может привести к увеличению входного сопротивления клеток и снижению тока реобазы, подобно изменениям, происходящим в мотонейронах после повреждения спинного мозга (63, 64), и способствовать повышению мышечного тонуса в состоянии покоя. Мы не нашли доказательств изменения размера сомы, длины дендритов и индекса ветвления в мотонейронах новорожденных кроликов с гипертонией, что позволяет предположить, что изменения пассивных мембранных свойств мотонейронов могут иметь ограниченный вклад в моторный фенотип.Однако в нашем исследовании мы не изучали плотность каналов и количество синапсов на мотонейронах.

Другим возможным объяснением повышенной возбудимости спинной сети после перинатальной травмы может быть нарушение обычно происходящего в процессе развития переключения действия ГАМК / глицина с возбуждающего на ингибирующее из-за перинатальной активации экструдеров хлорида, особенно транспортера хлорида калия KCC2 (61). Потеря или задержка активации KCC2 и недостаточность для развития гиперполяризующего хлоридного потенциала происходит после повреждения нисходящих выступов, как это наблюдается при перерезке спинного мозга новорожденных (65) и после различных видов нейротравм (23).Подавление экспрессии KCC2 было причастно к возникновению гипервозбудимости спинного мозга после повреждения спинного мозга (66). Потеря экспрессии транспортеров хлорида KCC1 и KCC2 была обнаружена в головном мозге младенцев с поражениями белого вещества (67). Наборы кроликов с гипертонией в нашем исследовании не показали потери содержания белка KCC2 в спинном мозге в точке P1, но имели более низкую экспрессию гена KCC2. Построенный нами профиль развития демонстрирует, что у кроликов экспрессия KCC2 низкая у плодов, но увеличивается в несколько раз в ранний постнатальный период.Поскольку моторные дефициты уже наблюдаются у новорожденных кроликов, мы заключаем, что маловероятно, что нарушение KCC2 способствует развитию мышечного гипертонуса в кроличьей модели антенатального повреждения H-I, но может играть роль в ХП человека, где моторные дефициты обычно развиваются постнатально.

Недавнее исследование на крысиной модели гипоперфузии плода (68) продемонстрировало стойкое повышение возбудимости мотонейронов на основе снижения RDD H-рефлекса, аналогично данным в наших данных на кроликах. Гиперрефлексивность нейронов связывают со снижением экспрессии KCC2 в спинном мозге крыс P8 после пренатальной гипоперфузии.Очевидные различия в роли KCC2 в вкладе в моторный дефицит между этой моделью и моделью на кролике могут быть связаны, помимо видовых различий, со временем начала и природой моторных дефицитов. В отличие от кроликов моторные дефициты в модели на крысах были обнаружены в более позднем развитии, легкие по своей природе и выявлялись по аномалиям ворот (69) и могут быть связаны с действием KCC2, которое происходит постнатально. Увеличение сопротивления сустава, зависящее от скорости, то есть спастичность, кратко упоминается в этой модели (69) и в модели неонатальной аноксии с ограничением конечности (70), но еще предстоит продемонстрировать объективными измерениями.В наших предыдущих публикациях мы сообщали, что сенсорные и моторные дефициты сохраняются, по крайней мере, до P11 (71) и P18 (28) в затронутых наборах без улучшения и очевидного изменения моторного фенотипа. Мы не обнаружили признаков спастичности в качественных (25) и количественных лабораторных измерениях скоростного мышечного тонуса на P1 (36).

Повышенный возбуждающий синаптический сигнал от сенсорных афферентов к мотонейронам может способствовать повышению мышечного тонуса. Нормальное созревание втягивания сенсорных афферентов в спинном мозге происходит из-за конкуренции с нисходящими моторными проекциями (72), которые могут быть нарушены после функционального или структурного повреждения нисходящих проекций (20, 73).Мы не нашли гистологических доказательств этого механизма в нашем исследовании, поскольку плотность первичных афферентов не была увеличена в наборах для кроликов с гипертонией. Это можно объяснить временем исследования ткани, которое проводилось у новорожденных кроликов на P1 и может предшествовать ретракции первичных афферентов, происходящей постнатально и в зависимости от активности нисходящих моторных проекций, как описано у кошек (16, 73).

Постоянным выводом среди различных животных моделей, приводящим к гипервозбудимости спинного мозга, является глиоз спинного мозга, вероятно, представляющий глиальную реакцию на нейровоспаление и нейродегенерацию после повреждения центральной нервной системы.Глиоз описан на модели повреждения головного и спинного мозга H-I (34), включая кроличью модель антенатального H-I (74), травму спинного мозга (75) и повреждение кортикоспинального тракта (18). Блокирование специфических для астроцитов рецепторов AMPA облегчало симптомы спастичности и ригидности после ишемического повреждения спинного мозга (34). В текущем исследовании мы сообщаем об увеличении астро- и микроглии в сером веществе спинного мозга гипертонических комплектов. Было предложено множество механизмов, объясняющих, как астроглия и активированная микроглия могут влиять на возбудимость спинномозговых нейронов, включая высвобождение BDNF, TNFα, цитокинов и стимулирование реактивного разрастания.Однако неясно, является ли глиоз основной причиной гипертонии в модели кролика H-I или вторичной реакцией на нейровоспаление, а также способствует гипервозбудимости позвоночника и двигательной недостаточности.

Есть несколько важных ограничений, которые необходимо рассмотреть в этом исследовании. Во-первых, количество животных в группе было относительно низким из-за практических трудностей с поднятием наборов больных до старшего возраста. Изученный возраст пораженных животных был ограничен P11 для H-рефлекса и P1 для остальных измерений из-за уже полностью выраженного и постоянного моторного дефицита у новорожденных после травмы E25 H-I (26).Возможно, мы не наблюдали наборов достаточно долго, чтобы обнаружить спастичность, которая обычно возникает у людей в более позднем развитии. Распространение исследования на более поздний постнатальный период позволит изучить специфические механизмы, относящиеся к CP человека, такие как изменения плотности сенсорных афферентов или экспрессии KCC2.

Во-вторых, исследуемые группы были ограничены животными с гипертонией и контрольной группой. В модели кроликов есть субпопуляция новорожденных, у которых наблюдается снижение мышечного тонуса или вялость, которая может быть преходящей и позже либо замещаться гипертонией, либо сохраняться (36).Гетерогенный моторный фенотип у новорожденных после глобального дородового повреждения HI у кроликов отражает сложность заболевания ХП у человека, где проявление типов моторного дефицита зависит от времени, тяжести и места травмы и представляет собой сочетание травмы головного мозга (27, 28) и прямого спинного мозга. травма (74) и нарушение развития. Из-за сжатой шкалы времени развития кролика по сравнению с человеком, двигательный дефицит у кроликов может развиваться относительно рано, даже во внутриутробном периоде. Типы двигательного дефицита у кроликов не полностью эквивалентны ХП человека, наиболее заметным отличием является отсутствие спастичности (25).Спастичность, которая объясняется постнатально развивающимся изменением собственной возбудимости мотонейронов, может развиться позже у кроликов, но может быть скрыта развитыми контрактурами, перенапряжением мышц и атрофией.

Похоже, что кроличья модель глобального дородового повреждения H-I отражает несколько характерных черт ХП у человека, таких как выраженный и стойкий моторный дефицит, включая гипертонию и ригидность осанки, повреждение белого и серого вещества головного и спинного мозга и аномальные свойства мышечных волокон.Важно, чтобы он моделировал повреждение, которое происходит в антенатальном периоде, поскольку большая часть ХП человека, независимо от типа, имеет дородовое происхождение (76). Antepartum H-I считается одним из наиболее важных факторов этиологии спастического ХП (77). Настоящее исследование подчеркивает гетерогенные механизмы, способствующие двигательному дефициту при ХП, одним из которых является гипервозбудимость позвоночника, которую необходимо рассматривать в конкретном контексте развития изучаемых видов.

Авторские взносы

SS, JL, LY, IG, RL и AD участвовали в сборе, анализе или интерпретации данных для работы.А.Д. задумал работу. AD, RL и JL разрабатывали проект и критически пересматривали его с точки зрения важного интеллектуального содержания.

Финансирование

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01 NS0-01A1 (AD)].

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

3.Грэм Х. К., Розенбаум П., Панет Н., Дэн Б., Лин Дж. П., Дамиано Д. Л. и др. Детский церебральный паралич. Nat Rev Dis Primers 2: 15082. DOI: 10.1038 / nrdp.2015.82

CrossRef Полный текст

4. Миллер С.П., Рамасвами В., Михельсон Д., Баркович А.Дж., Холшоузер Б., Уиклиф Н. и др. Особенности повреждения головного мозга при доношенной неонатальной энцефалопатии. J Pediatr. (2005) 146: 453–60. DOI: 10.1016 / j.jpeds.2004.12.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5.Sukal-Moulton T, Krosschell KJ, Gaebler-Spira DJ, Dewald JP. Факторы двигательной недостаточности, связанные со сроками травмы головного мозга при раннем гемипарезе. Часть I: проявление слабости в верхних конечностях. Neurorehabil Neural Repair (2014) 28: 13–23. DOI: 10.1177 / 1545968313500564

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Сангер Т.Д., Дельгадо М.Р., Геблер-Спира Д., Халлетт М., Норк Дж. У. Классификация и определение нарушений, вызывающих гипертонию в детском возрасте. Педиатрия (2003) 111: e89–97.DOI: 10.1542 / педс.111.1.e89

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Хагберг Х., Маллард С., Ферриеро Д.М., Ваннуччи С.Дж., Левисон С.В., Векслер З.С. и др. Роль воспаления в перинатальной травме головного мозга. Nat Rev Neurol. (2015) 11: 192–208. DOI: 10.1038 / nrneurol.2015.13

CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Clowry GJ. Зависимость развития спинного мозга от кортикоспинального входа и его значение в понимании и лечении спастического церебрального паралича. Neurosci Biobehav Rev. (2007) 31: 1114–24. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2007.04.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Деон Л.Л., Гейблер-Спира Д. Оценка и лечение двигательных нарушений у детей с церебральным параличом. Orthop Clin North Am. (2010) 41: 507–17. DOI: 10.1016 / j.ocl.2010.06.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Ivanhoe CB, Reistetter TA. Спастичность: неправильно понятая часть синдрома верхнего двигательного нейрона. Am J Phys Med Rehabil. (2004) 83 (10 Suppl.): S3–9. DOI: 10.1097 / 01.PHM.0000141125.28611.3E

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Чакрабарти С., Мартин Дж. Х. Совместное развитие проприоцептивных афферентов и кортикоспинального тракта в шейном отделе спинного мозга. Eur J Neurosci. (2011) 34: 682–94. DOI: 10.1111 / j.1460-9568.2011.07798.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Гибсон К.Л., Арнотт Г.А., Клоури Г.Дж.Пластичность спинного мозга крысы наблюдается в ответ на повреждения моторной коры во время развития, но не на повреждения в зрелом возрасте. Exp Neurol. (2000) 166: 422–34. DOI: 10.1006 / exnr.2000.7511

CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Тан А.М., Чакрабарти С., Кимура Х., Мартин Дж. Х. Селективное повреждение кортикоспинального тракта у крысы вызывает разрастание первичных афферентных волокон в спинном мозге и гиперрефлексию. J Neurosci. (2012) 32: 12896–908. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.6451-11.2012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Тайра Ю., Марсала М. Влияние давления проксимальной артериальной перфузии на функцию, кровоток спинного мозга и гистопатологические изменения после увеличения интервалов окклюзии аорты у крысы. Инсульт (1996) 27: 1850–8. DOI: 10.1161 / 01.STR.27.10.1850

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

20. Смит СС, Патон Дж. Ф. Р., Чакрабарти С., Ичияма Р. М.. Нисходящие системы направляют развитие ключевых моторных цепей позвоночника. Сокращенное название: постнатальное развитие моторных цепей позвоночника. Дж. Neurosci . (2017) 37: 6372–87. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0149-17.2017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Мюррей К.С., Накаэ А., Стивенс М.Дж., Ранг М., Д’Амико Дж., Харви П.Дж. и др. Восстановление мотонейронов и двигательной функции после повреждения спинного мозга зависит от конститутивной активности рецепторов 5-HT2C. Nat Med. (2010) 16: 694–700. DOI: 10,1038 / нм.2160

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Bos R, Sadlaoud K, Boulenguez P, Buttigieg D, Liabeuf S, Brocard C, et al.Активация рецепторов 5-HT2A усиливает функцию нейронального котранспортера K-Cl KCC2. Proc Natl Acad Sci USA. (2013) 110: 348–53. DOI: 10.1073 / pnas.1213680110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Жан-Ксавье С., Шарплз С.А., Майр К.А., Логнон А.П., Уилан П.Дж. Повторяя свои шаги: понимание развития пластичности позвоночной сети после травмы. J Neurophysiol. (2018) 119: 521–36. DOI: 10.1152 / jn.00575.2017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24.Куинлан К.А., Шустер Дж. Э., Фу Р., Сиддик Т., Хекман С. Джей. Измененное постнатальное созревание электрических свойств в спинномозговых мотонейронах в мышиной модели бокового амиотрофического склероза. J. Physiol. (2011) 589 (Pt 9): 2245–60. DOI: 10.1113 / jphysiol.2010.200659

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Деррик М., Луо Н.Л., Брегман Дж. К., Джиллинг Т., Джи Х, Фишер К. и др. Гипоксия-ишемия недоношенного плода вызывает гипертонию и двигательный дефицит у новорожденных кроликов: модель церебрального паралича человека? J Neurosci. (2004) 24: 24–34. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2816-03.2004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Тан С., Дробышевский А., Джиллинг Т., Джи Х, Ульман Л.М., Энглоф И. и др. Модель детского церебрального паралича у кролика в перинатальном периоде. J Детский нейрол. (2005) 20: 972–9. DOI: 10.1177 / 08830738050200120801

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Дробышевский А., Деррик М., Вирвич А.М., Джи Х, Энглоф И., Ульман Л.М. и др.Повреждение белого вещества коррелирует с гипертонией на животной модели церебрального паралича. J Cereb Blood Flow Metab. (2007) 27: 270–81. DOI: 10.1038 / sj.jcbfm.9600333

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Дробышевский А., Цзян Р., Линь Л., Деррик М., Луо К., Бэк С.А. и др. Потеря немиелинизированных аксонов с постнатальной гипертонией после гипоксии плода. Ann Neurol. (2014) 75: 533–41. DOI: 10.1002 / ana.24115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30.Ли Джей Ди, Пак Х. Дж, Парк Э. С., О М-К, Парк Би, Ра Д. В. и др. Повреждение двигательных путей у пациентов с перивентрикулярной лейкомаляцией и спастической диплегией. Мозг (2011) 134: 1199–210. DOI: 10.1093 / brain / awr021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Misiaszek JE. H-рефлекс как инструмент нейрофизиологии: его ограничения и использование для понимания функции нервной системы. Мышечный нерв (2003) 28: 144–60. DOI: 10.1002 / mus.10372

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33.Tekgül H, Polat M, Tosun A, Serdaroglu G, Gökben S. Электрофизиологическая оценка спастичности у детей с использованием H-рефлекса. Turk J Pediatr. (2013) 55: 519–23.

PubMed Аннотация | Google Scholar

34. Хефферан М.П., ​​Кучарова К., Кинджо К., Какинохана О., Секеркова Г., Накамура С. и др. Сверхэкспрессия глутаматного рецептора 1 спинного астроцита после ишемического инсульта способствует появлению поведенческих признаков спастичности и ригидности. J Neurosci. (2007) 27: 11179–91. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0989-07.2007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Пейн JA, Ривера C, Voipio J, Kaila K. Катион-хлоридные ко-транспортеры в нейрональной коммуникации, развитии и травмах. Trends Neurosci. (2003) 26: 199–206. DOI: 10.1016 / S0166-2236 (03) 00068-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Дробышевский А., Деррик М., Ло К., Чжан Л.К., Ву Ю.Н., Такада С.Х. и др. Кратковременная гипоксия-ишемия плода у кроликов: МРТ может прогнозировать нарушения мышечного тонуса и глубокое повреждение головного мозга. Инсульт (2012) 43: 2757–63. DOI: 10.1161 / STROKEAHA.112.653857

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

37. Либер Р.Л., Блевинс Ф.Т. Архитектура скелетных мышц задней конечности кролика: функциональные последствия дизайна мышц. J Morphol. (1989) 199: 93–101. DOI: 10.1002 / jmor.10519

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Mencalha R, Sousa CA, Costa O, Abidu-Figueiredo M. Ультразвуковое исследование и макроанатомия плечевого сплетения и основных нервов передней конечности.Анестезиологический подход с использованием домашнего кролика ( Oyctolagus cuniculus ) в качестве экспериментальной модели 1. Бюстгальтеры Acta Cir. (2016) 31: 218–26. DOI: 10.1590 / S0102-865020160040000001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Portal J-J, Corio M, Viala D. Локализация поясничных пулов мотонейронов, которые обеспечивают мышцы задних конечностей у кролика. Neurosci Lett. (1991) 124: 105–7. DOI: 10.1016 / 0304-3940 (91) -E

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41.Батлер А.Б., Ходос В. Спинной мозг. В: Сравнительная нейроанатомия позвоночных. John Wiley & Sons, Inc. (2005). п. 139–55. DOI: 10.1002 / 0471733849.ch8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Attaai A, Neidert N, von Ehr A, Potru PS, Zöller T., Spittau B. Постнатальное созревание микроглии связано с альтернативной активацией и активированной передачей сигналов TGFβ. Glia (2018) 66: 1695–708. DOI: 10.1002 / glia.23332

CrossRef Полный текст | Google Scholar

45.Шахани Б., Юнд Р. Исследования рефлекторной активности с клинической точки зрения. В: Аминофф М., редактор. Электродиагностика в клинической неврологии . Нью-Йорк, Нью-Йорк: Черчилль Ливингстон (1980). п. 290–30.

46. Funase K, Imanaka K, Nishihira Y. Возбудимость пула мотонейронов камбаловидной мышцы, выявленная по наклону развития H-рефлекса как усиление рефлекса. Electromyogr Clin Neurophysiol. (1994) 34: 477–89.

PubMed Аннотация | Google Scholar

47.Hultborn H, Nielsen JB. H-рефлексы и F-ответы не одинаково чувствительны к изменениям возбудимости мотонейронов. Мышечный нерв (1995) 18: 1471–4. DOI: 10.1002 / mus.880181219

CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Hultborn H, Illert M, Nielsen J, Paul A, Ballegaard M, Wiese H. О механизме постактивационной депрессии H-рефлекса у людей. Exp Brain Res. (1996) 108: 450–62. DOI: 10.1007 / BF00227268

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49.Хан Кью, Фенг Дж, Цюй Й, Дин И, Ван М., Со К.Ф. и др. Созревание спинного мозга и движение у мышей с изолированной корой. Неврология (2013) 253: 235–44. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2013.08.057

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Хосоидо Т., Мотояма С., Гото М., Мори Ф., Тадзима Т., Хирата Х. и др. Характеристики H- и M-волн, записанные на передних конечностях крысы. Neurosci Lett. (2009) 450: 239–41. DOI: 10.1016 / j.neulet.2008.11.045

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Turan E, Unsal C, Uner AG. Исследование H-рефлекса и M-волны на передних и задних конечностях кролика. Turk J Vet Anim Sci. (2013) 37: 559–63. DOI: 10.3906 / vet-1210-27

CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Капланис П.А., Паттичис К.С., Хаджилеонтиадис Л.Дж., Робертс В.К. Анализ поверхностной ЭМГ здоровых людей на основе изометрических произвольных сокращений. J Electromyogr Kinesiol. (2009) 19: 157–71. DOI: 10.1016 / j.jelekin.2007.03.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Мэтьюсон М.А., Чемберс Г.Г., Жирар П.Дж., Тененхаус М., Шварц А.К., Либер Р.Л. Жесткие мышечные волокна в икроножных мышцах пациентов с церебральным параличом приводят к высокой пассивной жесткости мышц. J Orthop Res. (2014) 32: 1667–74. DOI: 10.1002 / jor.22719

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Chatzisotiriou AS, Kapoukranidou D, Gougoulias NE, Albani M.Влияние неонатальной перерезки позвоночника и дорсальной ризотомии на мышцы задних конечностей. Dev Brain Res. (2005) 157: 113–23. DOI: 10.1016 / j.devbrainres.2005.02.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Стенд CM, Кортина-Борха MJ, Theologis TN. Накопление коллагена в мышцах детей с церебральным параличом и корреляция со степенью спастичности. Dev Med Child Neurol. (2001) 43: 314–20. DOI: 10.1017 / S0012162201000597

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56.Смит Л.Р., Ли К.С., Уорд С.Р., Чемберс Г.Г., Либер Р.Л. Контрактуры подколенного сухожилия у детей со спастическим церебральным параличом являются результатом более жесткого внеклеточного матрикса и увеличения длины саркомера на in vivo на . J. Physiol. (2011) 589 (Pt 10): 2625–39. DOI: 10.1113 / jphysiol.2010.203364

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. de Gooijer-van de Groep KL, de Vlugt E, de Groot JH, van der Heijden-Maessen HCM, Wielheesen DHM, van Wijlen-Hempel RS, et al.Дифференциация ненейральных и нервных факторов, влияющих на жесткость голеностопного сустава при церебральном параличе. J Neuroeng Rehabil. (2013) 10: 1–8. DOI: 10.1186 / 1743-0003-10-81

CrossRef Полный текст

58. Смит Л. Р., Чемберс Г. Г., Либер Р. Л.. Уменьшение популяции сателлитных клеток может привести к контрактурам у детей с церебральным параличом. Dev Med Child Neurol. (2013) 55: 264–70. DOI: 10.1111 / dmcn.12027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59.Даяниди С., Дыкстра ПБ, Любасюк В., Маккей Б.Р., Чемберс Х.Г., Либер Р.Л. Уменьшение количества сателлитных клеток in situ при мышечных контрактурах у детей с церебральным параличом. J Orthop Res. (2015) 33: 1039–45. DOI: 10.1002 / jor.22860

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Lang AH, Sillanpaa M, Hynninen P. Асимметричная функция периферических нервов у детей с церебральным параличом. Acta Neurol Scand. (1983) 67: 108–13. DOI: 10.1111 / j.1600-0404.1983.tb04551.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61. Vinay L, Brocard F, Pflieger JF, Simeoni-Alias ​​J, Clarac F. Перинатальное развитие поясничных мотонейронов и их входы у крыс. Brain Res Bull. (2000) 53: 635–47. DOI: 10.1016 / S0361-9230 (00) 00397-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62. Карраскал Л., Ньето-Гонсалес Дж. Л., Камерон В.Е., Торрес Б., Нуньес-Абадес, Пенсильвания. Изменения в постнатальном развитии физиолого-анатомических характеристик мотонейронов крысы изучали in vitro . Brain Res Brain Res Rev. (2005) 49: 377–87. DOI: 10.1016 / j.brainresrev.2005.02.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Бандару С.П., Лю С., Ваксман С.Г., Тан А.М. Дендритная дисгенезия позвоночника способствует гиперрефлексии после травмы спинного мозга. J Neurophysiol. (2015) 113: 1598–615. DOI: 10.1152 / jn.00566.2014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Button DC, Kalmar JM, Gardiner K, Marqueste T, Zhong H, Roy RR, et al.Изменяет ли устранение афферентного входа изменения свойств мотонейронов крысы, которые происходят после хронической перерезки спинного мозга? J. Physiol. (2008) 586: 529–44. DOI: 10.1113 / jphysiol.2007.141499

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Жан-Ксавье С., Пфлигер Дж. Ф., Лябеф С., Вине Л. Тормозящие постсинаптические потенциалы в мотонейронах поясницы остаются деполяризующимися после неонатальной перерезки спинного мозга у крысы. J Neurophysiol. (2006) 96: 2274–81. DOI: 10.1152 / jn.00328.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Boulenguez P, Liabeuf S, Bos R, Bras H, Jean-Xavier C, Brocard C и др. Снижение регуляции котранспортера хлорида калия KCC2 способствует спастичности после травмы спинного мозга. Nat Med. (2010) 16: 302–7. DOI: 10,1038 / нм. 2107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

67. Робинсон С., Миколаенко И., Томпсон И., Коэн М.Л., Гоял М.Потеря экспрессии котранспортера катион-хлорида у недоношенных детей с поражениями белого вещества: последствия для патогенеза эпилепсии. J Neuropathol Exp Neurol. (2010) 69: 565–72. DOI: 10.1097 / NEN.0b013e3181dd25bc

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68. Coq JO, Delcour M, Ogawa Y, Peyronnet J, Castets F, Turle-Lorenzo N, et al. Умеренная внутриутробная гипоперфузия приводит к повышенной возбудимости, спастичности и мышечной дисфункции поясницы и коры головного мозга у крыс: последствия для недоношенности. Передний Neurol. (2018) 9: 423. DOI: 10.3389 / fneur.2018.00423

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

69. Делькур М., Руссье М., Синь Д.Л., Массикотт В.С., Барб М.Ф., Кок Дж.О. Легкие изменения опорно-двигательного аппарата и опорно-двигательного аппарата у взрослых крыс с повреждением белого вещества после пренатальной ишемии. Int J Dev Neurosci. (2011) 29: 593–607. DOI: 10.1016 / j.ijdevneu.2011.02.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

70.Strata F, Coq JO, Byl N, Merzenich MM. Влияние сенсомоторного ограничения и аноксии на походку и организацию моторной коры: последствия для модели церебрального паралича на грызунах. Неврология (2004) 129: 141–56. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2004.07.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

71. Деррик М., Дробышевский А., Джи Х, Чен Л., Ян Й, Джи Х и др. Гипоксия-ишемия вызывает стойкий дефицит движений в перинатальной кроличьей модели церебрального паралича: по оценке с помощью нового теста плавания. Int J Dev Neurosci. (2009) 27: 549–57. DOI: 10.1016 / j.ijdevneu.2009.06.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

73. Чакрабарти С., Мартин Дж. Постнатальное уточнение проприоцептивных афферентов в шейном отделе спинного мозга кошек. Eur J Neuro Instit. Anim Care Sci (2011) 33: 1656–66. DOI: 10.1111 / j.1460-9568.2011.07662.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74. Дробышевский А, Квинлан К.А.Повреждение спинного мозга у новорожденных с гипертонической болезнью после антенатальной гипоксии-ишемии на кроличьей модели церебрального паралича. Exp Neurol. (2017) 293: 13–26. DOI: 10.1016 / j.expneurol.2017.03.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

75. Noristani HN, Saint-Martin GP, ​​Cardoso M, Sidiboulenouar R, Catteau M, Coillot C, et al. Продольный МРТ-анализ и гистологическая характеристика после повреждения спинного мозга у двух линий мышей с различным функциональным восстановлением: глиоз как ключевой фактор. J Neurotrauma (2018) 35: 2924–40. DOI: 10.1089 / neu.2017.5613

CrossRef Полный текст | Google Scholar

baillement-hyperplexia