Малютка состав смеси 1: Смесь Малютка 1 адаптированная 350г с 0месяцев

Детская молочная смесь МАЛЮТКА 1 — «Бомба замедленного действия »

Так сложились обстоятельства что нам пришлось познакомиться со смесью.

В 1,5 месяца наш ребёнок не наедался молоком, и часами висел на груди, и было приятно решение приобрести смесь.

Ребёнок у нас первый в семье, а значит и опыта как такого не было в выборе докорма.

По совету мы приобрели Малютку:

и на этом плюсы заканчиваются.

Перейдем к важному!

• Смесь плохо растворяется
• Имеет специфический запах
• В составе пальмовое масло
• Вызывает АЛЛЕРГИЮ и колики
• Не удобная картонная упаковка
• Запоры
• Появился запах мочи

И так с введением смеси мы стали спать всю ночь, Но наше счастье было не долгим.

Спустя неделю на лице нашего ребёнка появилось пару прыщиков, в силу своей неопытности мы пришли к выводу что это цветение. Малышка начала вести себя беспокойно, и мы познакомились с коликами. Борьба с животиком продолжалась около трёх дней, начался запор и истерики.

Спустя некоторое время появилось много газов, запах был ужасный. Цвет кала был зелёный, появился резкий запах мочи.А наше лицо всё больше обсыпало. Конечно я грешила на себя, что дело в моем питании, и нужно пересмотреть свой рацион. Посадив себя на строгую диету, результата не было. Посетив врача и объяснив ситуацию, врач нас успокоил и сказал ребёнок ещё маленький и колики это нормально, а на нашем лице всё таки цветение.

И вот настал день х, после очередного кормления лицо ребёнка было таким что без слез не взглянешь. Начались ужасные покраснения в области щёк и ушей, а когда малышка начинала плакать и напрягаться всё это становилось ещё ужаснее. И тут мы поняли кто источник наших проблем, каша тут же полетела в помойку.

Сменив смесь, ушёл запах газов и мочи. Наладился стул.Пропала шершавость щёчек, ушли покраснения и значительное количество прыщиков. Но борьба с ними по сей день продолжается.

Малютка Молочная смесь Premium 1, 350г (Хорол) 4820199500084 в Київі

Состав (100 гр сухой смеси): сухая деминерализованая молочная сыроватка (48,2%), высококачественное коровье молоко цельное и сливки (26,4%), растительные масла: кукурузное (6,9%), рапсовое (3,2%), коксовое (3,2%) молочный сахар (3,07%), галактоолигосахариды (6,9%), фруктоолигосахариды (0,2%), эмульгатор (лецитин) (0,045%), аскорбилпальмитат (0,005%), лимонная кислота (0,0001%). Обогащенная  нуклеотидами (0,2%): цитидин, уридин, аденозин, гуанозин, инозит, витаминами (0,10%): биотином, А, Д, Е, К, С, РР, В1, В2, В5, В6, ВС, В12, про-витаминами (0,10%): холином, инозитом, L-карнитином, таурином, минеральными веществами (1,5%): железо сернокислое, цинк сернокислый, медь сернокислая, калий йодистый, натрия селенит.

Предупреждение: Безусловное преимущество принадлежит грудному вскармливанию! Перед началом кормления ребенка до 1-го года не обходимо проконсультироваться с доктором-педиатром. Запрещается использование воды из колодцев и каптажных источников для приготовления детского питания.

Способ приготовления:

1. Тщательно вымыть руки.

2. Прокипятить всю посуду, предназначенную для кормления ребенка, на протяжении 3-5 минут.

 3. Налить в подготовленную бутылочку необходимое количество кипяченой и охлажденной до 36-37  °С воды.

4. В бутылочку с водой добавить необходимое количество мерных ложек смеси (см. таблицу кормления), снявши остаток порошка обратной стороной ножа.

5. Закрыть бутылочку и взболтать ее до полного растворения порошка.

6.  Проверить температуру смеси, капнувши несколько капель на внутреннюю строну запястья.

Обратите внимание:

—          Необходимо готовить смесь непосредственно перед употреблением.

—          Недопустимо использовать остатки готовой смеси для следующего кормления

—          Использование некипяченой воды, а также несоблюдение инструкции по приготовлению смеси могут привести к негативным последствиям для здоровья ребенка

1 мерная ложка* без горки содержит 4,5 г сухой молочной смеси.

Разводите 1 мерную ложку смеси в 30 мл воды.

Норма употребления смеси ребенком за одно кормление, и количество кормлений определяется рекомендациями доктора-педиатра в соответствии со схемой кормления
Возраст ребенка	Количество мерных ложек* на одно кормление	Объем воды на одно кормление, мл	Объем готовой смеси, мл	Рекомендованный объем одного кормления, мл	Количество кормлений в сутки
0-14 дней	3	90	100	60-80	6-7
2-6 недель	3	90	100	80-120	6
6-8 недель	4	120	135	120-140	6
2-3 месяца	4	120	135	130-150	6
3-4 месяца	5	150	165	150-160	5-6
4-5 месяцев	5	150	165	160-180	4-5
5-6 месяцев	6	180	200	180-200	3-4

 Формат упаковки: 350 г.

Молочная смесь Малютка 1, 300 г — ГигМаркет

Описание

Молочная смесь Малютка 1, 300 г

Детская молочная смесь «Малютка 1» — это комплексная полноценная и нежная забота о самых маленьких. Смесь обязательно понравится малышу и обеспечит его всем необходимым для здоровья и роста, так как ее состав адаптирован к грудному молоку. Она улучшит пищеварение и обеспечит Вашему малышу сбалансированное питание и комплексную заботу, поскольку в ее состав входят пищевые волокна, питательные вещества, минералы и витамины, специально подобранные для растущего детского организма.
Нуклеотиды, входящие в состав смеси, способствуют созреванию иммунной системы и развитию мозга. Также смесь обогащена железом для профилактики развития анемии, йодом для нормального роста и интеллектуального развития, селеном для укрепления иммунитета. «Малютка 1» отвечает как современным российским, так и международным стандартам качества. Сбалансированный состав смеси обеспечивает полноценное развитие младенца. Продукт одобрен Союзом педиатров России.

Условия хранения
В сухом месте, при температуре до +25`C

Характеристики

Тип	Молочная смесь
Назначение	Для здоровых детей
Ступень кормления	(с рождения)
Форма выпуска смеси	Сухая
Вес товара, г	300
Энергетическая ценность, ккал/100 г	478
Срок годности в днях	540

Единиц в одном товаре	1
Артикул	4600209011096
Вид молока	Коровье
Страна-изготовитель	Россия
Упаковка	Картонная коробка
Размер упаковки (Длина х Ширина х Высота), см	14 x 6 x 19
Вес в упаковке, г	350

Название	Молочная смесь Малютка 1, 300 г
Не содержит	ГМО, Ароматизаторы, Искусственные добавки, Сахар
Состав	Деминерализованная молочная сыворотка, смесь растительных масел (пальмовое, рапсовое, кокосовое, подсолнечное, Mortierella alpina), мальтодекстрин, молоко обезжиренное, пребиотики (галактоолигосахара, фруктоолигосахара), концентрат белков молочной сыворотки, лактоза, минеральные вещества, рыбий жир, витаминный комплекс, холин, эмульгатор соевый лецитин, таурин, микроэлементы, нуклеотиды, инозит, L-триптофан. Может содержать следы глютена. Содержит 17 витаминов, 12 минералов (в том числе: кальций, йод, железо, селен). Пищевая ценность на 100 г сухого продукта: белки — 9,7 г, жиры — 24,5 г, углеводы — 54,2 г.

Информация о технических характеристиках, комплекте поставки, стране изготовления и внешнем виде товара носит справочный характер и основывается на последних доступных к моменту публикации сведениях

МАЛЮТКА 1 СМЕСЬ СУХАЯ МОЛОЧНАЯ 300,0

МАЛЮТКА® 1 молочная смесь сухая адаптированная с пребиотиками для питания детей с рождения, 0+

Производители объединили свой многолетний опыт и технологии компании Nutricia, чтобы создать современную формулу Малютка®1 с NutriComplex*.

NutriComptex — это формула, соответствующая российским и международным стандартам качества, созданная для гармоничного роста и развития Вашего малыша:

• L-карнитин, Липиды и Йод — дают малышу энергию для полноценного роста;

• Омега 3, Омега 6 и Холин — поддерживают развитие центральной нервной системы;

• Пребиотики ГОС/ФОС и Нуклеотиды — помогают наладить пищеварение крохи;

• Кальций, Витамин D, Фосфор — способствуют формированию крепких костей.

Малютка 1 с NutriComplex объединяет в себе заботу, любовь, накопленный многолетний опыт и современные технологии для гармоничного роста и развития Ваших малюток. Малютка 1 — питание для детей с рождения, если исключительно грудное вскармливание невозможно.

Nutricia. Международные стандарты качества

-Оптимальная рецептура

-Качественные ингредиенты

-Современное производство

-Строгий контроль

Малютку производит компания Nutricia, эксперт в питании для детей раннего возраста. Именно поэтому Малютка соответствует и российским, и международным стандартам качества. У нее оптимальная рецептура, высокие стандарты и строгий контроль производства, качественные ингредиенты.

-Гарантия качества

-Без использования сахара

-Европейские ингредиенты

-Без консервантов

-Без красителей

-Без искусственных пищевых добавок

-Без ГМО

Грудное молоко — идеальное питание для роста и развития малыша. Но при его недостатке или отсутствии возможности грудного вскармливания, Малютка поможет маме позаботиться о сбалансированном рационе малыша. Смесь Малютка 1 с рождения содержит:

— Пребиотики ГОС/ФОС — натуральные пищевые волокна, по составу и свойствам приближенные к пребиотикам грудного молока для улучшения пищеварения;

— Витамины и минералы, необходимые для гармоничного развития в соответствии с возрастом малыша.

— Омега 3 и Омега 6 жирные кислоты для развития нервной системы.

Омега 3 и Омега 6 — это жирные кислоты, которые необходимы для здорового развития нервной системы малыша. У новорожденных детей омега-3 и омега-6 образуются в ограниченном количестве, поэтому необходимо их дополнительное поступление в составе грудного молока или смеси. Адекватное и сбалансированное количество жирных кислот в питании малыша необходимо для правильного роста и развития всех органов и тканей, именно поэтому в Новой формуле МАЛЮТКА® содержатся омега-3 и омега-6 жирные кислоты.

Пребиотики ГОС/ФОС (галактоолигосахариды/фруктоолигосахариды) — натуральные пищевые волокна, по эффектам приближенные к пребиотикам грудного молока. Пребиотики необходимы для улучшения пищеварения малыша, а их оптимальное сочетание помогает правильному развитию собственной здоровой микрофлоры кишечника. Данный комплекс пребиотиков обеспечивает регулярный мягкий стул у малышей.

МАЛЮТКА® 1 соответствует потребностям малыша первого полугодия жизни. В этой смеси содержатся питательные вещества, витамины и минералы, оптимизированные с учетом возраста малютки, для его гармоничного роста.

Пальмовое масло — важный компонент, входящий в состав смеси масел, которые легко и быстро усваиваются детским организмом. Пальмовое масло необходимо для приближения жирового компонента смеси к жировому составу грудного молока. Пальмитиновая кислота, которой богато пальмовое масло — поставщик энергии для растущего организма, как и пальмитиновая кислота в грудном молоке.

ВАЖНО:

• Для питания детей раннего возраста предпочтительнее грудное вскармливание;

• Малютка используется как заменитель грудного молока, если грудное вскармливание невозможно;

• Перед применением смеси проконсультируйтесь cо специалистом;

• Несоблюдение инструкций по приготовлению и хранению смеси может нанести вред здоровью ребенка;

• Никогда не оставляйте Вашего ребенка одного во время кормления;

• Для детского питания;

• Не допускается назначать детям, имеющим аллергию на любой компонент, входящий в состав продукта.

ВНИМАНИЕ:

• Готовьте питание непосредственно перед употреблением!

• Не используйте остатки питания для последующего кормления!

• Не подогревайте смесь в СВЧ-печи во избежание образования горячих комочков смеси.

• Строго соблюдайте рекомендации по количеству смеси при приготовлении и ничего не добавляйте в приготовленную смесь.

• Новую смесь в рацион ребенка необходимо вводить постепенно.

Пищевая ценность на 100 мл готового продукта

Белок 9,6 г

Жир 24,3 г

Углеводы 55 г

Энергетическая ценность кДж/ккал 487/2045

Осмоляльность 290 мОсм/кг

Малютка 1 смесь молочная с рождения,300 грамм

«Смесь молочная сухая начальная адаптированная с пребиотиками 1» Малютка для питания детей с рождения,Дизайн пачки может отличаться от представленной картинки. 

Nutricia. Международные стандарты качества

• Оптимальная рецептура
• Качественные ингредиенты
• Современное производство
• Строгий контроль

Малютку производит компания Nutricia, эксперт в питании для детей раннего возраста. Именно поэтому Малютка соответствует и российским, и международным стандартам качества. У нее оптимальная рецептура, высокие стандарты и строгий контроль производства, качественные ингредиенты.

Грудное молоко – идеальное питание для роста и развития малыша. Но при его недостатке или отсутствии возможности грудного вскармливания, Малютка поможет маме позаботиться о сбалансированном рационе малыша. Смесь Малютка 1 с рождения содержит:

— Пребиотики ГОС/ФОС – натуральные пищевые волокна, по составу и свойствам приближенные к пребиотикам грудного молока для улучшения пищеварения

— Витамины и минералы, необходимые для гармоничного развития в соответствии с возрастом малыша.

— Омега 3 и Омега 6 жирные кислоты для развития нервной системы

ВАЖНО:

• Для питания детей раннего возраста предпочтительнее грудное вскармливание.
• Малютка используется как заменитель грудного молока, если грудное вскармливание невозможно.
• Перед применением смеси проконсультируйтесь cо специалистом.
• Несоблюдение инструкций по приготовлению и хранению смеси может нанести вред здоровью ребенка.
• Никогда не оставляйте Вашего ребенка одного во время кормления.
• Для детского питания.
• Не допускается назначать детям, имеющим аллергию на любой компонент, входящий в состав продукта.

ВНИМАНИЕ:

• Готовьте питание непосредственно перед употреблением!
• Не используйте остатки питания для последующего кормления!
• Не подогревайте смесь в СВЧ-печи во избежание образования горячих комочков смеси.
• Строго соблюдайте рекомендации по количеству смеси при приготовлении и ничего не добавляйте в приготовленную смесь.
• Новую смесь в рацион ребенка необходимо вводить постепенно.

Условия хранения. Продукт хранят при температуре от 0 °С до 25 °С и относительной влажности не более 75%. После вскрытия пакета хранить продукт в сухом прохладном месте, но не в холодильнике, плотно закрытым, не более 3 недель.

Мерная ложка внутри коробки.

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ:

1. Вымойте руки и простерилизуйте бутылочку и соску.

2. Прокипятите воду. Охладите ее до 40 °С.

3. В соответствии с таблицей кормления отмерьте точное количество воды и налейте в простерилизованную бутылочку. Не используйте повторно кипяченую воду.

4. Обязательно используйте прилагаемую мерную ложку. Обработайте кипящей водой прилагаемую мерную ложку, высушите ее. Снимите горку сухой смеси тыльной стороной ножа

5. Добавьте точное количество мерных ложек смеси в воду. Добавление большего или меньшего, чем указано в инструкции, количества смеси может нанести вред здоровью Вашего ребенка.

6. Закройте бутылочку и хорошо взболтайте до полного растворения порошка.

Молочная смесь «Малютка» для новорожденных, отзывы педиатров

В этой статье:

Правильное питание – основа здоровья ребенка первого года жизни. Самой полезной едой для малыша является мамино молоко. К сожалению, не всегда женщина в силу определенных причин имеет возможность кормить ребенка грудью. Иногда маминого молока недостаточно и требуется докорм. Для замены грудного вскармливания придуманы адаптированные молочные смеси. Современный рынок содержит такой большой выбор детского питания, что определиться сложно не только маме, но даже педиатру. Достаточно востребованной является молочная смесь «Малютка» компании «Нутриция».

Производитель позаботился о том, чтобы продукт был максимально приближен по составу к маминому молоку. К сожалению, универсальной смеси не существует. Поэтому отказ от грудного вскармливания и переход на искусственное питание требует четко обоснованной мотивации. Необходимо понимать, что только грудное молоко является единственной идеально подходящей для малыша едой. Чтобы кроха рос здоровым и хорошо развивался, при переходе на смесь важно подобрать подходящую. Прежде чем определиться с выбором, необходимо рассмотреть достоинства, недостатки и узнать мнение педиатров об этом продукте.

Достоинства смеси Малютка

Производитель – компания «Нутриция» известна во всем мире благодаря своим научным разработкам и исследованиям в области питания. Полувековое изучение состава и свойств грудного молока привели к появлению современной максимально адаптированной молочной смеси для искусственного вскармливания.

Сегодня смесь «Малютка» выгодно отличается от своих предшественников – смесей, производимых в России ранее. Главное отличие – снижение соотношения белков в продукте, что обуславливает его лучшее усвоение.

Положительно характеризуют смесь для грудничка «Малютка» содержащиеся в ней:

• жирные кислоты;
• пребиотики;
• витамины и минералы, которые подобраны с учетом возраста ребенка.

Жирные кислоты Омега 3 и Омега 6 способствуют правильному развитию нервной системы крохи. Если новорожденный находится на грудном вскармливании, то материнское молоко полностью удовлетворяет его потребность в жирных кислотах. Чтобы малыш-искусственник не испытывал дефицита в жирных кислотах, они включены в состав смеси «Малютка».

Для улучшения пищеварения младенца в состав смеси добавлены пребиотики – вещества, которые не меняются в верхних отделах кишечника и подвергаются ферментированию лишь в нижних отделах, за счет чего полезная флора активно развивается. Это способствует более качественному перевариванию пищи и нормализации стула ребенка.

Пребиотики содержатся в виде олигосахаридов в женском молоке. А вот в коровьем их почти нет. Смесь «Малютка» обогащена пребиотиком инулином, источником которого является цикорий. Инулин помогает увеличить количество бифидо- и лактобактерий в кишечнике крохи.

В состав детского питания этого производителя входят витамины, микроэлементы, способствующие правильному развитию ребенка и предотвращению дефицитных состояний. Количество этих добавок подобрано в строгом соответствии с возрастными потребностями малыша.

Смеси «Малютка» не содержат сахара. Раньше сахароза добавлялась для увеличения питательности продукта. Современные технологии позволяют не делать этого, а сладкий вкус достигается использованием мальтодекстрина и лактозы.

К плюсам смеси нужно отнести натуральный состав. Питание легко растворяется в теплой воде, соска не забивается. Приятным бонусом к этому будет демократичная доступная цена, которая делает продукцию этого производителя доступной для молодых родителей.

В пользу «Малютки» говорит то, что все ее компоненты производятся в странах Европы, проходят обязательную сертификацию, являются безопасными для малыша. Молоко, из которого производят питание, проверяется еще до попадания на завод на предмет качества кормов, безопасности и условий, в которых содержались коровы. Контролю подвергается не только сырье, из которого производят смеси, но и упаковка, вплоть до качества наносимой на коробку краски.

Состав смесей максимально адаптирован к потребностям крохи и приближен к составу грудного молока. У питания приятный вкус, поэтому детки кушают его охотно. В качестве плюсов можно отметить разнообразный ассортимент выпускаемой продукции под маркой «Малютка».

Положительно характеризует детские смеси этого производителя проводимые клинические исследования. В ходе них доказано, что пребиотики в составе «Малютки» уменьшают дискомфорт в ЖКТ, нормализуют стул малыша.

Недостатки

Наряду с плюсами, в составе смеси можно выделить и минусы.

Они относительны, но все же встречается настороженное отношение к наличию в питании:

• пальмового масла;
• соевого лицетина.

Дискуссии по поводу вреда-безвредности пальмового масла не утихают на сегодняшний день. Многие не находят в нем ничего опасного. По сути, это обычный растительный жир, применяется большинством производителей детского питания в качестве ингредиента смесей и каш.

Противники этого компонента говорят о его вреде здоровью, особенно детскому. Но это масло употребляли в пищу еще 5 тысяч лет назад, а оливковое и подсолнечное масла появились гораздо позже. Концентрация полезных веществ в пальмовом масле выше, чем в остальных.

Противники его утверждают, что продукт плохо усваивается организмом. Однако доказана более высокая усваиваемость его по сравнению с молочным жиром. При производстве питания для детей используется качественное, хорошо очищенное пальмовое масло, что гарантирует его безопасность. Применение этого ингредиента в детском питании обусловлено тем, что жиры грудного молока на 25% представлены пальмитиновой кислотой, источником которой является пальмовое масло.

Родителей может настораживать наличие соевого лецитина в смеси. Это связано с опасением, что для его получения могла быть использована генно-модифицированная соя. На самом деле для производства этого компонента применяют соевое масло, прошедшее многоступенчатую качественную очистку. Важно понимать, что сам лецитин – необходимый и полезный элемент питания малыша. Поэтому, выбирая детскую смесь, следует отдавать предпочтение проверенным производителям, имеющим хорошую репутацию.

Какие бывают смеси марки «Малютка»?

Производителем выпускаются следующие виды молочной смеси «Малютка»:

• №1 – для малышей от рождения до полугода;
• №2 – от полугода до года.

Для подросших малышей компанией «Нутриция-Истра» представлено детское молочко №3 от 1 года и детское молочко №4 для возраста от полутора лет. Также в линейке детского питания этого производителя присутствует кисломолочная смесь для новорожденных «Малютка».

Молочные смеси имеют определенные отличия в составе. «Малютка» №1 содержит молочную дименерализованную сыворотку, пальмовое, подсолнечное, рапсовое масла, арахидоновую кислоту, рыбий жир, витамины, лактозу, мальтодекстрин, микроэлементы, соевый лецитин, L-триптофан, натуральные пищевые волокна-пребиотики, жирные кислоты Омега 3 и омега 6.

В отличие от смеси №1, в «Малютка 2» добавлен L-карнитин и изменен набор витаминов и микроэлементов на максимально соответствующий возрасту ребенка от полугода до года. Эта смесь содержит много казеиновых белков, которые сложнее усваиваются, но являются более питательными. Поэтому второй номер смеси не рекомендуют деткам младше 6 месяцев, чтобы избежать проблем с пищеварением.

В «Малютку 2» добавлено железо в сочетании с витамином С и цинком. Это позволяет железу лучше усваиваться детским организмом и предотвратить развитие анемии. Обе эти смеси не содержат консервантов, красителей, сахара и искусственных добавок.

Состав детского молочка похож на состав смесей. К ингредиентам добавлены L-изолейцин и L-цистеин. Пропорции остальных компонентов изменены в соответствии с возрастными потребностями малыша, чтобы питание его было максимально сбалансированным и полноценным.

Линейка продуктов «Малютка» содержит кисломолочную смесь. Положительно характеризует ее наличие в компонентах смеси живых кисломолочных бактерий, которые подавляют рост болезнетворных микроорганизмов в ЖКТ ребенка, способствуют росту полезных и снижают газообразование, а, следовательно, предотвращает появление колик.

Этот продукт также в составе содержит железо, способствующее профилактике железодефицита у малыша. Кисломолочная смесь для новорожденных «Малютка» содержит все необходимые витамины и микроэлементы, хорошо усваивается и укрепляет иммунную систему крохи. В составе продукта нет сахара, что уменьшает вероятность появления проблем с пищеварением у ребенка. Смесь можно использовать как основное питание.

Как перейти на эту смесь с другой?

Если педиатр по каким-либо причинам рекомендует переход на смесь «Малютка», то сделать это необходимо в соответствии с некоторыми правилами. Перемены в питании могут стать настоящим стрессом и испытанием для организма крохи, поэтому делать это безосновательно не рекомендуется.

Правила перехода на смесь для грудничка «Малютка» с других смесей:

• Переходить на другую смесь необходимо постепенно. Даже самое лучшее и адаптированное искусственное питание для малыша в случае резкого перехода может привести к расстройству пищеварения.
• При переходе к новой смеси ее следует разводить в отдельной от старой смеси бутылочке.
• Новую смесь нужно дать в начале кормления в небольшом количестве.
• Сначала новую смесь нужно вводить в дневные кормления, чтобы была возможность внимательно наблюдать за реакцией крохи. Если продукт подходит, то его вводят в утренние, а затем и вечерние кормления.
• Если никаких негативных реакций малыша не наблюдается, то постепенно увеличивают количество новой смеси, а предыдущей — уменьшают.

Если во время перехода к новой смеси у ребенка начались колики, проблемы со стулом, срыгивания, рвота, колики, понос или запор, аллергическая реакция, эксперимент следует остановить и обратиться за консультацией к педиатру.

Существует множество рекомендаций и схем, как правильно перевести малыша на новое питание. Все они похожи и построены на основном правиле – постепенности.

Например, можно рекомендовать в первый день дать попробовать крохе в начале дневного кормления всего лишь 10 мл новой смеси. На второй день дополнить уже три кормления небольшой дозировкой (10 мл). Если малыш реагирует на изменения в рационе хорошо, то в третий день выбирают три дневных кормления и дают уже по 30 мл новой смеси. На четвертый день можно заменить 50 мл привычного ранее питания на протяжении всех кормлений, на пятый – 100 мл. В дальнейшем, при условии, что новая смесь подошла — старая убирается.

Чтобы перевести кроху на другую смесь, маме нужно приложить усилия и не спешить. Может возникнуть соблазн не тратить время и сразу кормить ребенка новой смесью. Как бы этого ни хотелось, так делать нельзя! Не стоит экспериментировать со здоровьем. Резкий переход может вызвать расстройства пищеварения и аллергические реакции у малыша.

Что считают педиатры?

Компания «Нутриция» систематически проводит независимые опросы педиатров для объективной оценки качества своей продукции. Исследования говорят, что за последние годы число специалистов, рекомендующих смесь «Малютка», увеличилось в несколько раз. Положительные отзывы педиатров о смеси «Малютка» для новорожденных подтверждают правильность выбора мам.

Основанием для таких рекомендаций является следующее:

• высокое качество смеси;
• соответствие современным критериям;
• оптимально подобранный состав, способствующий правильному развитию малыша, хорошему пищеварению.

Указанные критерии в сочетании со строгим контролем качества, безопасностью продукта позволяют педиатрам быть уверенным в своем выборе при рекомендации смеси для искусственного и смешанного питания.

Смесь «Малютка» зачастую рекомендуется педиатрами как наиболее доступная по цене. Это большое преимущество, потому как со временем расходы на питание ребенка увеличиваются, и родители, пользующиеся дорогими смесями, вынуждены переходить на более дешевые. А перемена питания не всегда безобидна для животика крохи.

Смесь «Малютка» — современный адаптированный качественный продукт для искусственного и смешанного вскармливания ребенка. Благодаря тщательно подобранному составу и широкому ассортименту продукция компании «Нутриция» пользуется спросом среди мам. Если существуют объективные причины применения смеси, то преимущества «Малютки» очевидны: это ее безопасность и высокое качество. Прежде чем определиться с выбором, необходимо посоветоваться с педиатром.

Полезное видео о производстве молочных смесей

Детская смесь Малютка: эффективность применения и разновидности

Последнее обновление статьи: 02.05.2019

1993 год стал годом начала сотрудничества Российской Федерации с Всемирной организацией здравоохранения по программе поддержки грудного вскармливания. В обществе создаются условия для того, чтобы кормление грудью стало не только популярным, но и возможным с самого рождения. Однако, существует ряд случаев, когда приходится докармливать или полностью переводить младенца на искусственное вскармливание. Объективно оценить необходимость смены рациона может только врач – педиатр. Он же определит, чем докармливать ребенка.

Немного из истории создания смеси Малютка

Детская молочная смесь Малютка является проверенным годами питанием для малышей, нуждающихся в искусственном вскармливании. Впервые она появилась на прилавках магазинов СССР в 1972 году. Несмотря на то, что место производства не поменялось, от советской «Малютки» осталось только название. Сейчас продукция под этим брендом разрабатывается и изготавливается специалистами фирмы Nutricia.

Молочная смесь этого производителя рекомендуется для кормления новорожденных, а также детей до трех лет. Каждой возрастной группе присущи разные потребности в минеральных веществах, поэтому смесь Малютка имеет несколько разновидностей.

Малютка 1 ступень

Эта смесь предназначена для питания новорожденных. В ее состав входят три основные группы веществ, необходимые для полноценного роста и развития младенца.

1. Энергообразующие – жиры, белки, углеводы. Данный продукт содержит производные молока, масла растительные (в том числе и пальмовое), мальтодекстрин. Соотношение расщепляющих веществ и белка 60:40 позволяет не нагружать слабо сформировавшуюся ферментативную систему новорожденных. Лактоза входит в состав для формирования здоровой микрофлоры кишечника. Углеводы присутствуют благодаря как животным, так и растительным компонентам.Пальмовое масло – несмотря на шумиху в СМИ по этому компоненту, это важный и полезный компонент детского питания. Оно усваивается организмом малыша на 5% лучше, чем молочный жир. Модифицированное пальмовое масло, входящее в состав детской смеси – признак качественной, современной продукции.
2. Витамины. Помимо стандартного набора витаминов, состав обогащен таурином, необходимым для развития мозговых структур. Холин является помощником кроветворной системы, снижает восприимчивость к инфекциям кишечника. Фолиевая кислота нужна для формирования зрелой нервной системы.
3. Минералы. Кальций служит строительным материалом для зубов и костей. Железо предотвращает анемии, йод нужен для здоровой щитовидной железы.

Существует также кисломолочная «Малютка» для новорожденных.

Продукт первой ступени можно давать грудничкам до 6 месяцев.

После полугода изменяются потребности ребенка в питательных веществах, поэтому состав питания ребенка тоже становится другим. Необходимо переходить на следующую ступень в линейке заменителей ГВ.

Малютка 2 ступень

Полугодовалые малыши нуждаются в большей калорийности питания в отличии от новорожденных. Сделать рацион более сытным помогают казеиновые белки. Не все минералы могут усвоиться в чистом виде, поэтому фирма «Нутриция» создала комплекс «умное железо».

Малютку второй ступени дают деткам от 6 до 12 месяцев.

И вот вам исполнился годик. Пора переходить на так называемое детское молочко.

Малютка 3 ступень

После года рацион малыша уже в меньшей степени, чем раньше, состоит из молока. Однако отказываться от этого кладезя витаминов еще рано.

Можно использовать питание не в чистом виде, а при приготовлении быстрорастворимых каш.

Малютка 4 ступень

Предназначена для детей от 18 до 36 месяцев. Состав аналогичен предыдущей ступени. Меняется только процентное содержание элементов.

Если у вашего малыша диагностирована непереносимость лактозы, то наилучшим выходом будет кисломолочная смесь. Истринский завод производит питание для детей с такими проблемами. Также кисломолочная составляющая гарантирует отсутствие колик и запоров. Сбалансирован состав порошка таким образом, что подходит для возрастной группы от нуля до года.

 Как приготовить и сколько хранить смесь

Как хранить

Для снижения себестоимости упаковка выполнена из картона. Для того, чтобы можно было не опасаться отсыревания порошка, производитель применяет метод расфасовки в специальные герметичные металлизированные пакеты.

После вскрытия такой упаковки возможно поглощение дегидратированым продуктом влаги из окружающего воздуха. В результате чрезмерного увлажнения образуются комки. Питание может затвердевать. Поэтому, после вскрытия пакета поместите порошок в плотно закрывающуюся емкость.

Хранить смесь надо при невысокой влажности. На практике это означает, что не стоит помещать такой вид питания, например, в холодильник. Можно просто оставить его на кухонной полке.

Как приготовить для использования

Основные «ингредиенты» правильно приготовленного заменителя грудного молока это:

1. стерильная бутылочка
2. кипяченая и охлажденная до 40 градусов Цельсия вода
3. соблюдение пропорций воды и смеси

На картонной упаковке даны подробные инструкции — в каком соотношении разводить сухое питание.

Сколько можно хранить готовую смесь и как приготовить ее для путешествий

Питательная среда, тепло, влага – идеальные условия для размножения патогенных микроорганизмов. Когда вы готовите молоко дома, невозможно добиться такой же стерильности, как на производстве. Поэтому хранить разведенное сухое питание можно только при пониженных температурах.

Если в бутылочке осталось значительное количество молока, то просто поставьте ее в холодильник. Соску накройте стерильной крышкой. Когда ребенок вновь проголодается, питание подогрейте, не переливая в другие емкости. Соску смените на чистую.

Все же не стоит злоупотреблять и хранить уже использовавшуюся смесь. Продукция Истринского завода сочетает в себе высокое качество и приемлемую цену. Не стоит экономить на здоровье карапуза.

Животрепещущей темой для не кормящих грудью мам является приготовление молочка вне дома. К примеру, вы решили отправиться к родственникам в другой конец города или рискнули посетить курорт. Для недалеких поездок можно приготовить смесь заранее, охладить в холодильнике и перевозить в термоконтейнере.

А что делать тем, кто вынужден лететь на самолете? Правила запрещают перевозить жидкости массой более 100 грамм. Тогда берем с собой чистые бутылочки и запас смеси.

Горячую воду из кипятильников самолета ни в коем случае нельзя употреблять для приготовления еды карапузу, так как это – не кипяченая вода.

И дело не в халатности проводников. Согласно законам физики, чем ниже давление — тем меньше температура воды. Понижение точки кипения на эшелоне не обеспечивает нагрев, необходимый для стерилизации.

Выход все же есть. Бутилированная вода отвечает необходимым гигиеническим требованиям для приготовления еды и питья маленьким детям. Нагреть смесь можно в емкости с подогретой водой из кипятильника.

Если вы едете на поезде или машине — то просто возьмите кипяток в термосе с собой.

Как правильно дать заменитель грудного молока в первый раз?

Состав «Малютки» адаптирован к потребностям ребенка соответственно возрасту. Несмотря на это, некоторые родители склонны объяснять проблемы со здоровьем малыша низким качеством специализированных детских продуктов.

Сколько разочарований можно было бы избежать, если ответственно подойти к процессу введения новых продуктов в рацион ребенка.

Правильно начинать прикорм следует с микропорций. Первая проба для ребенка не должна превышать 10 миллилитров.

Не нужно высчитывать, сколько порошка следует добавить в воду такого объема. Состав веществ в неправильно разведенном питании способен вызвать различные нарушения, вплоть до крайней степени обезвоживания. Не рискуйте здоровьем малыша.

Возьмите 30 мл воды и растворите в них 1 мерную ложечку (без горки) порошка. Из полученного объема 10 мл дайте на пробу ребенку. Далее внимательно наблюдайте за реакцией организма младенца.

Понятно, что на ночь не стоит устраивать подобные эксперименты. Для полного усвоения веществ, входящих в состав заменителя маминого молока, необходимо в среднем 70 (максимум 86) минут. Соответственно, первые признаки отрицательного влияния будут видны через 1,5 часа.

Среди возможных проблем могут быть:

1. сыпь,
2. рвота,
3. запор,
4. колики.

Если вы все еще кормите грудью, важно особо строго соблюдать диету. В противном случае будет сложно понять, что вызвало диатез или другие виды проблем у малыша.

Сколько на свете существует веществ — столько же есть и причин аллергии. Не меняйте даже порошок или моющее средство, когда переходите на смешанное или искусственное вскармливание.

Отзывы и видео о смеси Малютка

Часто можно услышать вопрос мам — чем лучше та или иная марка заменителей грудного молока. Эта тема непрестанно обсуждается на просторах интернета и в кабинетах педиатров.

Попробовавшие несколько заменителей грудного молока различных фирм родители выделяют ряд положительных свойств продукта Истринского завода.

По их словам, она отлично растворяется в воде, не образует комочков, которые могут закупорить соску. Вкус ее больше, чем у более дорогих аналогов (а ведь состав их примерно одинаков, сколько бы они ни стоили) походит на молоко. У разведенного молока нет неприятного кислого запаха, малыши любят его за сладковатый вкус.

Педиатры прописывают этот продукт тем, кто плохо набирает вес. Дополнительным плюсом является и то, что «Малютка» входит в перечень бесплатно выдаваемого детского питания. Так же ее несложно найти в обычных продуктовых магазинах любого города.

Посмотрите видео обзор смеси Малютка от одного из пап.

 

Boots Gripe Mixture, 1 месяц плюс — сводка характеристик продукта (SmPC)

Эта информация предназначена для медицинских работников

Детская смесь для гриппа или смесь для гриппа, или смесь для гриппа без сахара для младенцев, или смесь для гриппа для детей 1 месяц плюс или смесь для гриппа для обуви, 1 месяц плюс

Действующее вещество	% Количество
Бикарбонат натрия EP	1.0 в / в

Для снятия ветра и схваткообразных болей. Для перорального применения. Дети до 1 месяца: не рекомендуется. Дети от 1 до 6 месяцев: 5 мл. Младенцы от 6 месяцев до 1 года: 10 мл. Вышеуказанные дозы можно повторять до или после каждого кормления до шести раз в течение 24 часов, если необходимо. Не рекомендуется для детей старше 1 года. Повышенная чувствительность к бикарбонату натрия или любому из его ингредиентов. Метаболический или респираторный алкалоз Гипокальциемия Гипохлоргидрия Пациенты, соблюдающие диету с низким содержанием натрия. Застойная сердечная недостаточность. Отек / задержка жидкости. Гипертония / эклампсия. Нарушение функции почек. Цирроз печени. Альдостеронизм. Младенцы в возрасте до одного месяца или старше одного года.Не превышайте рекомендованную дозу, так как чрезмерное употребление может привести к алкалозу. Это лекарство следует давать ребенку проглотить до или после кормления. Включение этого лекарства в корм или бутылки не изучалось, и его следует избегать. Храните все лекарства в недоступном для детей месте. Воздействие пероральных бикарбонатных соединений на повышение внутрижелудочного pH может снижать или увеличивать скорость и / или степень всасывания ряда лекарственных средств. Подщелачивание мочи приводит к увеличению почечного клиренса кислых препаратов, таких как салицилаты, тетрациклины и барбитураты.И наоборот, он продлевает период полураспада основных лекарств. Бикарбонат натрия усиливает выведение лития. Безопасность бикарбоната натрия во время беременности и кормления грудью не установлена, но его использование в эти периоды не считается опасным. Нарушения со стороны иммунной системы: редко — реакции гиперчувствительности, включая кожную сыпь. Нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта: спазмы желудка, отрыжка, метеоризм, рвота. Общие расстройства и условия в месте введения: недомогание. почечная функция

Сообщение о предполагаемых побочных реакциях

Сообщать о предполагаемых побочных реакциях после получения разрешения на лекарственный препарат очень важно.Это позволяет непрерывно контролировать соотношение польза / риск лекарственного средства. Медицинских работников просят сообщать о любых предполагаемых побочных реакциях через схему желтых карточек по адресу: www.mhra.gov.uk/yellowcard . Передозировка этим лекарством может вызвать симптомы гипернатриемии, которые могут включать сонливость и раздражительность, гипертермию, тахипноэ и гиперпноэ. В более тяжелых случаях острой перегрузки натрием могут наблюдаться признаки обезвоживания и судороги. Лечение гипернатриемии включает устранение любого присутствующего обезвоживания и постепенное снижение уровня натрия в плазме.Алкалоз, если он присутствует, обычно поддается лечению гипернатриемии. Постоянно необходим интенсивный мониторинг электролитов, кровообращения и центральной нервной системы пациента. Бикарбонат натрия обладает антацидными свойствами. Бикарбонат натрия вызывает нейтрализацию желудочного сока с образованием углекислого газа. Любой бикарбонат, не участвующий в этой реакции, абсорбируется, и при отсутствии дефицита бикарбоната в плазме бикарбонат-ионы выводятся с мочой, которая становится щелочной, что сопровождается диурезом.Жидкий мальтит, глицерин, цитрат натрия, домифен бромид, яблочный ароматизатор, 5112O1, очищенная вода, диоксид углерода 24 месяца без открытия12 недель после открытия Не хранить при температуре выше 25 ° C. Бутылка из прозрачного полиэтилентерефталата с полипропиленовой крышкой, защищенной от доступа детей, с расширенным полиэтиленовым вкладышем. Размер упаковки: 150 мл The Boots Company Plc1 Thane Road West Ноттингем NG2 3AA

Дата первого разрешения:	24 октября 1990 г.
Дата последнего обновления:	20 февраля 1996 г.

Влияние конкретной смеси олигосахаридов детской смеси на местный иммунитет и развитие аллергических и инфекционных заболеваний у маленьких детей: рандомизированное исследование

Резюме

Цель

Целью нашего открытого проспективного рандомизированного исследования питания было оценить влияние кормление стандартной детской смесью, обогащенной специфической смесью олигосахаридов, влияет на местную систему пищеварительного иммунитета и дальнейшее развитие аллергических и инфекционных заболеваний у детей раннего возраста.

Материал и методы

В зависимости от типа кормления младенцы были разделены на 3 группы (со случайным распределением в одну из групп кормления смесями): 80 младенцев, находившихся на грудном вскармливании, 80 младенцев, потребляющих смесь с добавлением олигосахаридов, 80 младенцев кормят по стандартной рецептуре.

Результаты

Младенцы, находящиеся на грудном вскармливании, имели самое высокое содержание бифидобактерий и лактобактерий в кале (9,047 ± 1,075 и 7,26 ± 0,65 КОЕ / г соответственно). У младенцев, которых кормили смесью с добавлением scGOS / lcFOS, концентрации Bifidobacteria и Lactobacilli в фекалиях были аналогичны таковым у младенцев на грудном вскармливании (8.92 ± 1,011 и 7,22 ± 0,74 КОЕ / г соответственно). Было обнаружено, что у младенцев, которых кормили грудным молоком и детскими смесями, было значительно меньше аллергических реакций на продукты питания по сравнению с младенцами из третьей группы (3,92% и 4,84% против . 16,98% соответственно; p <0,05) .

Выводы

Смесь пребиотических олигосахаридов (scGOS / lcFOS — 9: 1; 8 г / л), как и грудное молоко, оказывает положительное влияние на факторы местного пищеварительного иммунитета у детей, находящихся на искусственном вскармливании.Этот эффект может снизить риск аллергических и инфекционных заболеваний у детей в возрасте до 18 месяцев по сравнению с детьми, которых кормят стандартной смесью без олигосахаридов.

Ключевые слова

пребиотиков

олигосахариды

Местный иммунитет

болезненности

Младенцы

Słowa kluczowe

prebiotyki

oligosacharydy

lokalna odporność

zachorowalność

niemowlęta

Рекомендованные статьи articlesCiting (0)

Показать аннотацию

Copyright © 2013 Польское педиатрическое общество.Опубликовано Elsevier Sp. зоопарк.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Легочный сурфактант у новорожденных и детей

Реферат

• Чтобы понять состав, секреторные пути и функции легочного сурфактанта.

• Рассмотреть клинические данные об использовании сурфактантов у новорожденных и детей.

• Для понимания более редких нарушений метаболизма сурфактантов.

• Чтобы понять последние разработки и будущие перспективы в области поверхностно-активных веществ.

Резюме Легочный сурфактант представляет собой сложную смесь определенных липидов, белков и углеводов, которая продуцируется в легких альвеолярными эпителиальными клетками II типа. Смесь является поверхностно-активной и снижает поверхностное натяжение на границе раздела воздух-жидкость альвеол. Присутствие таких молекул с поверхностной активностью подозревалось с начала 1900-х годов и было окончательно подтверждено в середине 1900-х годов.С тех пор химические, физические и биологические свойства смеси ПАВ были выявлены благодаря работе нескольких групп исследователей.

Смесь поверхностно-активных веществ является важной группой молекул, поддерживающих дыхание воздухом. Таким образом, у недоношенных детей, рожденных с незрелыми легкими и дефицитом сурфактанта, после рождения развивается респираторный дистресс-синдром. Замена естественной сурфактантной терапии очищенным сурфактантом из легких нечеловеческих видов является одним из наиболее значительных достижений в неонатологии и привела к улучшению пределов жизнеспособности недоношенных детей.Хотя недоношенные дети составляют первичную популяцию, лечение экзогенными сурфактантами также может играть роль в других респираторных заболеваниях доношенных младенцев и детей старшего возраста.

Введение и историческая справка

Определение

Легочные сурфактанты представляют собой комплекс специфических липидов, белков и углеводов, секретируемых альвеолярными эпителиальными клетками II типа. Комплекс является амфифильным (, т.е. , он содержит как гидрофобные, так и гидрофильные группы), что делает его идеально подходящим в качестве поверхностно-активного агента для снижения поверхностного натяжения на границе раздела воздух-жидкость в альвеолах во время дыхательного цикла.Для целей этого обзора сурфактант будет использоваться для обозначения легочного сурфактанта млекопитающих.

Ранняя история

В 1929 году Курт фон Нергаард выдвинул идею о том, что «ретракционные силы легких зависят от поверхностного натяжения в альвеолах, и это может быть причиной ателектаза в легких новорожденного». [1] В элегантных экспериментах, проведенных на образцах легких от мертворожденных и новорожденных младенцев, умирающих в течение 3 дней после рождения (шесть из 15 имели низкий вес при рождении), Грюнвальд [2] продемонстрировал, что ателектатические легкие труднее надуть воздухом, чем жидкости и требовали более высокого давления.При добавлении амилацетата, поверхностно-активного агента, давление накачивания снижалось, предполагая, что поверхностное натяжение было причиной сопротивления раздуванию. Эти наблюдения были подтверждены в экспериментах на ex vivo легких недоношенных новорожденных, умирающих от болезни гиалиновых мембран (HMD; патологическое описание респираторного дистресс-синдрома, см. Ниже). Эти легкие могли расширяться в присутствии жидкости, но при расширении на воздухе развивался ателектаз с участками чрезмерного растяжения [3].Паттл [4] предоставил доказательства наличия подкладочного слоя в альвеолах, который снижает поверхностное натяжение, проводя эксперименты по стабильности пузырьков. Он продемонстрировал, что этот слой не мог образоваться из сыворотки (или жидкости отека легких), но должен секретироваться в легких. Изучая противопенные агенты для предотвращения отека легких, Паттл [5] провел подробные эксперименты, чтобы показать физическое свойство легочной жидкости в снижении поверхностного натяжения. Он также продемонстрировал присутствие и важность белковых компонентов в легочной жидкости, которая теряла свои поверхностно-активные свойства при инкубации с панкреатином или трипсином.Используя модифицированные весы Вильгельми (модель для изучения поверхностных пленок), Эйвери [1] и его коллеги продемонстрировали, что поверхностное натяжение экстрактов легких недоношенных детей, умирающих от HMD, имеет более высокое поверхностное натяжение по сравнению с более зрелыми младенцами, детьми или взрослыми. Они предположили, что это может быть важным фактором в патогенезе HMD.

Жидкость выстилки альвеол коров была извлечена Паттлом и Томасом [6], и было отмечено, что она содержит в основном лецитин и желатин с небольшим процентным содержанием белка.Используя метод экстракции, предложенный Бондюрантом и Миллером [7], Клементс [8] и его коллеги извлекли жидкость выстилки альвеол из легких крупного рогатого скота. Они продемонстрировали более сложную смесь липидов и белков, принадлежащих к трем различным категориям: ненасыщенные фосфолипиды (поверхностно-активный компонент), нефосфорилированные липиды и белки в качестве скелета. О первой демонстрации пленки поверхностно-активного вещества с помощью электронной микроскопии сообщили Weibel и Gil [9], которые использовали отдельные методы фиксации для сохранения слоя во время обработки.С тех пор несколько других исследователей продолжили изучение состава и свойств легочного сурфактанта [10, 11].

Состав ПАВ

Экстракция ПАВ

Легочный сурфактант существует в двух основных пулах: внутриклеточном и внеклеточном. Большая часть наших знаний об этом комплексе получена в результате изучения внеклеточного пула, секретируемого альвеолярными эпителиальными клетками типа II в альвеолярное пространство. При изучении внутриклеточные пулы сурфактанта (ламеллярные тела) обнаруживают сходство с альвеолярными компонентами [12].Поскольку этапы экстракции и очистки легочного сурфактанта могут влиять на состав смеси, процесс очистки необходимо тщательно рассматривать при интерпретации результатов исследований [13]. Предыдущие источники легочного сурфактанта (пена отека легких [3]) были заменены фракционированными гомогенатами легких и альвеолярными промывками для экстракции с последующим центрифугированием в градиенте плотности для очистки компонентов [14].

Композиция

Сурфактант млекопитающих, выделенный бронхоальвеолярным лаважем и очищенный центрифугированием, обнаруживает сходство химического состава у разных видов.На рисунке 1 показан состав бычьего сурфактанта, представляющего легочный сурфактант млекопитающих, содержащий 80–85% фосфолипидов, 5–10% нейтральных липидов и 5–10% поверхностно-активных апопротеинов [16]. Фосфатидилхолин (PC) является основным фосфолипидным компонентом сурфактанта млекопитающих и является основным компонентом, ответственным за снижение поверхностного натяжения в альвеолах. Большая часть PC в поверхностно-активном веществе млекопитающих присутствует в виде пальмитоил-PC либо с ацильными группами двунасыщенной пальмитиновой кислоты (дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC)), либо с двунасыщенным PC.Теперь ясно, что DPPC является первичной поверхностно-активной молекулой на границе раздела воздух-жидкость в альвеолах, при этом фосфатидилглицерин (PG), вероятно, играет второстепенную роль [16]. Точные функции других фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и сфингомиелин) и нейтральных липидов (холестерина и диацилглицерина) еще предстоит выяснить [15].

фигура 1

Состав ПАВ. Показан типичный состав бычьего сурфактанта из жидкости лаважа легких.Компоненты выражены в процентах от веса. DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин; PA; фосфатидная кислота; ПЭ: фосфатидилэтаноламин; PG: фосфатидилглицерин; ИП: фосфатидилинозитол. Воспроизведено из [15] с разрешения издателя.

Состав липидных компонентов

Поскольку ПК являются основными поверхностно-активными компонентами поверхностно-активного вещества и поскольку поверхностное натяжение является результатом разницы в притяжении молекул на границе раздела, химическая структура ПК является важным определяющим фактором их функции.PC и PG состоят из трехуглеродного скелета с гидрофильной головной группой (холин или глицерин), которая взаимодействует с жидкой фазой, и сильно гидрофобными липидными боковыми цепями (ацильными группами). Боковая цепь в DPPC представляет собой полностью насыщенную (гидрированную) пальмитиновую кислоту. Насыщение ацильной цепи позволяет молекуле образовывать упорядоченные монослои и дает возможность прочно сжиматься (во время выдоха — свойство, необходимое для уменьшения поверхностного натяжения при малых объемах легких). Моно- или диненасыщенность вызывает «изгибы» в молекуле, которые делают ее менее податливой сжатию во время дыхания.Это делает DCCP идеальной молекулой для снижения поверхностного натяжения в альвеолах [15, 16].

Состав белковых компонентов

От 5 до 10% поверхностно-активного вещества (вес / вес) состоит из белковых компонентов [16], которые представляют собой смесь сывороточных и несывороточных белков. В настоящее время установлено существование четырех отдельных не связанных с сывороткой сурфактантов белков. Их называют сурфактантным белком (SP) -A, SP-B, SP-C и SP-D. Хотя генетическое происхождение и функции этих белков были выяснены, количество каждого белка в комплексе сурфактанта достоверно не известно [15].

SP-A представляет собой гликопротеин массой 26–35 кДа, принадлежащий к семейству лектинов С-типа млекопитающих, содержащих участки коллагена, называемые коллагинами [17]. Он синтезируется из двух генов человека, SFTPA1 и SFTPA2 , на длинном плече хромосомы 10. В зрелом гидрофильном белке аминоконцевая часть состоит из обширной коллагеноподобной области с глобулярным карбоксильным концом, содержащим домены узнавания углеводов. Олигомерная форма SP-A состоит из гексамеров, которые, возможно, остаются связанными с трансформирующим фактором роста-β в неактивном состоянии и диссоциируют в активное состояние при воспалительных стимулах [18].SP-A специфически и активно связывается с DPPC, что указывает на ключевую роль в гомеостазе сурфактанта [19]. Известно по крайней мере восемь различных рецепторов-кандидатов и связывающих белков для SP-A, некоторые из которых экспрессируются исключительно на альвеолярных клетках типа II [17], и предлагаются новые [20]. Хотя легкие являются основным местом синтеза SP-A, было показано, что этот белок присутствует в других тканях, включая ткани кишечника, эндокринной системы и среднего уха [17]. Это может быть связано с его ролью в качестве защитного белка хозяина у млекопитающих.

SP-D представляет собой коллектин массой 43 кДа, синтезируемый геном SFTPD на длинном плече хромосомы 10, в непосредственной близости от генов SP-A. Общая структура зрелого белка аналогична структуре SP-A, но олигомерная форма состоит из тримеров и других комплексов высокого порядка [15]. SP-D связывается с второстепенными компонентами поверхностно-активного вещества фосфатидилинозитолом и глюкозилцерамидом [21], и, таким образом, его роль в гомеостазе поверхностно-активного вещества не ясна. Описаны три рецептора-кандидата для SP-D, которые являются общими с SP-A, но ни один из них не экспрессируется на клетках альвеолярного эпителия типа II.Экспрессия SP-D широко распространена в клетках млекопитающих, вероятно, в соответствии с его ролью как молекулы иммунной защиты [17].

SP-B представляет собой гидрофобный полипептид из 79 аминокислот (а.о.), синтезируемый геном SFTPB на хромосоме 2, и всегда остается связанным с поверхностно-активными фосфолипидами. Его олигомерная форма состоит из димеров и тетрамеров [22].

SP-C — самый гидрофобный белок в сурфактанте, состоящий из 35 аминокислот, синтезируемых геном SFTPC на хромосоме 8 [15].Структура ядерного магнитного резонанса SP-C предполагает, что это трансмембранный белок, который может охватывать жидкий бислой DPPC [22].

Жизненный цикл легочного сурфактанта

Развитие эпителия

Развитие легкого во время органогенеза начинается примерно на 3-4 неделе беременности в виде зачатка из передней кишки; Дальнейшее развитие происходит в пять различных стадий, которые пересекаются по своим концам [23]. В конце второй стадии (псевдогландулярной), на 16 неделе беременности, трахеобронхиальное дерево полностью сформировано и выстлана недифференцированным эпителием, окруженным мезенхимой.Во время третьей, или канальцевой, стадии развития развиваются респираторные бронхиолы и альвеолярные протоки, а выстилающий их эпителий дифференцируется на клетки типа I и типа II. Пластинчатые тела (см. Ниже) и белок сурфактанта могут быть обнаружены в кубовидных эпителиальных клетках типа II примерно на 24 неделе беременности. Эти клетки богаты гликогеном, который, возможно, действует как предшественник поверхностно-активных фосфолипидов, и имеют все органеллы, необходимые для синтеза поверхностно-активного вещества. Дальнейшее развитие эпителия и секреция сурфактанта, а также увеличение сложности воздушных пространств происходит на заключительных стадиях развития легких, по сравнению с , саккулярной и альвеолярной стадиями.Сурфактант, секретируемый в воздушное пространство внутриутробно. может быть обнаружен в околоплодных водах на более поздних сроках беременности, и это было основой клинического теста для определения зрелости легких [24].

Синтез, секреция и переработка поверхностно-активных веществ

Этапы жизненного цикла поверхностно-активного вещества изображены на рисунке 2 [13]. Биосинтез и процессинг сурфактантных фосфолипидов и белков происходит в эндоплазматическом ретикулуме и тельцах Гольджи альвеолярных эпителиальных клеток II типа. Эти молекулы затем транспортируются и хранятся (кроме SP-A) в структурах, называемых пластинчатыми телами, вероятно, после прохождения незрелых стадий, называемых мультивезикулярными телами и составными телами [25].Пластинчатые тельца представляют собой лизосомоподобные органеллы, состоящие из ограничивающей двухслойной мембраны с фосфолипидными двухслойными листами, тонкого ободка и центрального ядра из гранулированного материала. Во время экзоцитоза ограничивающая мембрана ламеллярного тела сливается с плазматической мембраной эпителиальной клетки, в результате чего содержимое изливается в альвеолярное пространство [26]. Содержимое, богатое фосфолипидами, связывается с сурфактантными белками, особенно с SP-A, и собирается в специфичную для легких структуру, называемую тубулярным миелином, который действует как резервуар сурфактанта во время альвеолярного дыхания и усиливает введение липидов на поверхность раздела воздух-жидкость.Стадии, участвующие в образовании тубулярного миелина, до конца не изучены, но они зависят от кальция, что продемонстрировано разборкой тубулярного миелина в присутствии хелатора кальция этиленгликольтетрауксусной кислоты [25]. Во время дыхания воздухом пленка сурфактанта подвергается воздействию высокого давления при малых объемах легких, что способствует десорбции липидов сурфактанта. Часть этого десорбированного липида рециркулируется клетками типа II, где они подвергаются эндоцитозу через мультивезикулярные тельца, в конечном итоге сохраняясь в пластинчатых тельцах для секреции [25].Другие части могут рециклироваться внеклеточно в канальцевый миелин, тогда как остальная часть поглощается макрофагами для деградации. Считается, что переработка сурфактанта является частью объяснения долговременных эффектов замены экзогенного сурфактанта у недоношенных детей.

фигура 2

Биологический жизненный цикл легочного сурфактанта в альвеолярных клетках II типа. Дополнительные сведения, включая переработку поверхностно-активного вещества, см. В основном тексте. ER: эндоплазматический ретикулум; G: тела Гольджи; LB: пластинчатые тела; ТМ: трубчатый миелин; М: монослой; I: альвеолярная эпителиальная клетка I типа; II: альвеолярная эпителиальная клетка II типа.Воспроизведено из [13] с разрешения издателя.

Функции поверхностно-активного вещества

Липидные компоненты

Основная функция липидного компонента сурфактанта — снизить поверхностное натяжение в альвеолах на границе раздела воздух-жидкость. Проще говоря, поверхностное натяжение является результатом сил притяжения (разности давлений) между молекулами на поверхности. Для жидкостей, чем выше перепад давления (сила притяжения), тем выше их поверхностное натяжение. Чтобы свести к минимуму поверхностное натяжение, наиболее стабильным является состояние, когда площадь поверхности самая низкая, то есть для жидкостей это сфера.Это связано с формулой Юнга и Лапласа: Δ P = 2 γ / r , где Δ P — разность давлений, γ — поверхностное натяжение и r — радиус сфера. Поверхностное натяжение определенной жидкости можно изменить, добавив вторую жидкость, уменьшающую силы притяжения. На поверхности смеси жидкостей одни молекулы с высокими силами притяжения заменяются другими с более низкими силами притяжения, что снижает поверхностное натяжение.

Фосфолипиды в поверхностно-активном веществе, будучи амфипатическими молекулами, образуют монослой на границе раздела воздух-жидкость, где они вытесняют молекулы воды с поверхности, чтобы снизить натяжение. Чем плотнее упакован этот монослой, тем больше они вытесняют воду и тем ниже поверхностное натяжение. Это то, что происходит при малых объемах легких, например, при окончании выдоха. Фосфолипиды с насыщенными боковыми цепями, такие как DPPC, могут образовывать высокоупорядоченные и плотно упакованные пленки в течение продолжительных периодов времени, в то время как ненасыщенность предотвращает такую ​​плотную упаковку [16].Таким образом, DPPC считается идеальной молекулой поверхностно-активного вещества для снижения поверхностного натяжения альвеол.

Белковые компоненты

Молекулы липидов могут переходить из жидкого состояния в гелевое состояние. Критическая температура, при которой происходит это фазовое изменение, называется T _c . Для DPPC T _c составляет 41 ° C; таким образом, чистый DPPC находится в гелеобразном состоянии ниже этой температуры, предотвращая распространение монослоя в альвеолах с образованием поверхностно-активной пленки.Клиническое значение этого свойства состоит в том, что, хотя DPPC является химически идеальным поверхностно-активным фосфолипидом, ему не хватает физических свойств для снижения поверхностного натяжения до более низких значений при температуре тела (37 ° C).

Notter et al. [27] показали, что смесь насыщенных и ненасыщенных фосфолипидов придает благоприятные адсорбционные свойства. Однако они ясно продемонстрировали важность белковых компонентов поверхностно-активного вещества для адсорбции в присутствии кальция.И SP-B, и SP-C значительно усиливают адсорбцию смесей, содержащих DPPC, при этом SP-B имеет эффект, близкий к естественному поверхностно-активному веществу [22]. В экспериментальных условиях они также придают пленкам поверхностно-активных веществ физические свойства, способствующие достижению ими низкого поверхностного натяжения при сжатии. Повторному распространению сжатой пленки поверхностно-активного вещества во время дыхания также способствуют гидрофобные белки SP-B и SP-C. SP-A принимает активное участие в образовании пленки из смесей фосфолипидов, содержащих SP-B, кальций-зависимым образом.Однако точный механизм, с помощью которого каждая из этих молекул проявляет свое действие, еще не известен.

Помимо физического воздействия на сурфактант, сборник SP-A играет критическую роль в защите хозяина [17]. Он усиливает связывание, фагоцитоз и уничтожение нескольких бактериальных, вирусных и грибковых патогенов. Точно так же SP-D имеет домен распознавания углеводов, который может связывать и агглютинировать бактерии, вирусы и грибы. Для SP-D не было продемонстрировано никакой роли гомеостаза сурфактанта. Таким образом, сурфактанты SP-A и SP-D выполняют важные защитные функции хозяина в легких.

Клиническое применение сурфактанта у новорожденных

Респираторный дистресс-синдром новорожденных

Респираторный дистресс-синдром (РДС) является прототипом дефицита сурфактанта у недоношенных новорожденных. Младенцы, рожденные на пределе жизнеспособности (гестационный возраст ≤28 недель), имеют незрелые легкие с серьезным дефицитом продукции сурфактанта. После рождения они нуждаются в респираторной поддержке и, как говорят, у них развивается RDS. Это в первую очередь характеризуется сочетанием клинических (недоношенность и респираторный дистресс) и рентгенологических (малый объем легких, помутнение «матового стекла», воздушные бронхограммы и потеря границ сердца на рентгенограммах грудной клетки; рис.3) особенности. Другие названия, используемые для этого состояния — синдром дефицита сурфактанта и HMD.

Рисунок 3

Неонатальный респираторный дистресс-синдром (РДС). Рентгенограмма грудной клетки при неонатальном респираторном дистресс-синдроме с генерализованным помутнением легочных полей «матового стекла» с обеих сторон, воздушными бронхограммами (маленькие стрелки) и потерей границ сердца (пустые стрелки). Эндотрахеальный и назогастральный зонд — in situ . Изображение любезно предоставлено С. Барром, Университетская больница Уэльса, Кардифф, Великобритания (из личной коллекции).

После открытия поверхностно-активных веществ в 1950-х годах Эйвери [1] и его коллеги отметили, что легкие недоношенных новорожденных, умирающих от HMD, имеют более высокое поверхностное натяжение по сравнению с более зрелыми младенцами и детьми. После двух десятилетий исследований физических и химических свойств сурфактанта (см. «Ранняя история») и испытаний на животных моделях [28], экзогенная замена сурфактанта была впервые использована на недоношенных людях в Японии [29]. Хотя это было обсервационное исследование, за ним последовало несколько рандомизированных контролируемых исследований (РКИ) в следующем десятилетии, которые подтвердили клинические преимущества снижения смертности и заболеваемости у недоношенных детей [30, 31].

Большинство клинических испытаний профилактического сурфактанта у недоношенных детей проводились в эпоху, когда ни антенатальные кортикостероиды, ни современные неинвазивные режимы респираторной поддержки, такие как постоянное положительное давление в дыхательных путях (CPAP), не использовались в повседневной практике. Метаанализ испытаний показал, что у младенцев <30 недель гестации, интубированных вскоре после рождения в родильном зале или до начала клинического РДС, использование профилактического природного (легкого животного или околоплодных вод человека) сурфактанта привело к значительному снижение частоты пневмотораксов, интерстициальной эмфиземы легких, неонатальной смертности и комбинированного исхода бронхолегочной дисплазии (БЛД) в возрасте 28 дней или смерти по сравнению с контрольной группой плацебо [32].В этот метаанализ были включены в общей сложности девять РКИ, в которых приняли участие 1256 младенцев. Профилактические искусственные (безбелковые) сурфактанты у недоношенных детей с риском РДС также привели к снижению риска неонатальной смертности и синдромов утечки воздуха по сравнению с плацебо, хотя все испытания, включенные в этот обзор, проводились до широкого применения антенатальных кортикостероидов. или ранний CPAP [33]. Результаты использования протеинсодержащих искусственных поверхностно-активных веществ в качестве профилактики или лечения RDS (два испытания) были сопоставимы с результатами натуральных поверхностно-активных веществ животного происхождения [34].Испытания, сравнивающие профилактическое (до начала клинического РДС) и избирательного (после наблюдения клинических признаков РДС) использования сурфактанта (полностью естественного происхождения) у недоношенных детей <30 недель гестационного возраста, до широкого применения антенатальных кортикостероидов или CPAP сообщил о значительном снижении риска неонатальной смертности, комбинированного исхода БЛД или смерти через 28 дней и утечки воздуха из легких [35]. Однако при сравнении этих двух стратегий в исследованиях с участием детей грудного возраста, у которых было преимущество дородовых кортикостероидов и рутинного раннего CPAP для контроля младенцев [36, 37], вышеуказанные преимущества были менее очевидными.Напротив, профилактическое использование сурфактанта было связано со значительным увеличением риска БЛД через 28 дней и комбинированным исходом БЛД или смерти через 28 дней [35]. Использование натуральных сурфактантов (животного происхождения) для лечения РДС привело к значительному снижению риска смертности и пневмотораксов [38] по сравнению с искусственными сурфактантами [39], хотя искусственные сурфактанты действительно показали клиническую пользу [40]. После начала клинического РДС испытания, сравнивающие раннее (профилактическое) использование сурфактанта (как природного, так и синтетического), продемонстрировали значительное снижение риска неонатальной смертности, БЛД на 36 неделе скорректированного гестационного возраста, комбинированного исхода ПРЛ или смерти в 36 лет. недель скорректировали гестационный возраст и синдромы утечки воздуха (пневмоторакс и интерстициальная эмфизема легких) по сравнению с поздним (спасательным) применением сурфактанта (при ухудшении RDS) [41].Многократные дозы сурфактанта приводят к значительному снижению риска пневмоторакса и смертности у недоношенных новорожденных с РДС, находящихся на ИВЛ, по сравнению с однократной дозой сурфактанта [42]. Однако у большинства младенцев, участвовавших в этом сравнении, не было преимуществ антенатальных кортикостероидов. Стратегия раннего применения сурфактанта с последующей плановой экстубацией (до неинвазивной респираторной поддержки) у недоношенных новорожденных с клиническими признаками РДС приводит к снижению риска потребности в ИВЛ, БЛД в возрасте 28 дней и синдромов утечки воздуха по сравнению с введение сурфактанта и длительная ИВЛ [43].

Таким образом, любая замена экзогенного сурфактанта в качестве профилактики или для лечения РДС дает важные клинические преимущества. Природные поверхностно-активные вещества (околоплодные воды животных или человека) клинически превосходят существующие синтетические поверхностно-активные вещества. После появления RDS чем раньше будет использовано сурфактант, тем лучше результаты. Стратегия раннего введения сурфактанта с последующей экстубацией недоношенных детей с РДС, по-видимому, дает лучшие результаты по сравнению с длительной вентиляцией после введения сурфактанта.

Синдром неонатальной аспирации мекония

Аспирация мекония у доношенных или недоношенных младенцев имеет тяжелые респираторные последствия, включая механическую обструкцию дыхательных путей [44], изменения легочного газообмена и комплаентности [44] и инактивацию сурфактанта [45] из-за химического пневмонита [46]. У младенцев с тяжелым синдромом аспирации мекония (MAS) развивается стойкая легочная гипертензия, и им может потребоваться временная поддержка с помощью стратегии обхода легких, называемой экстракорпоральной мембранной оксигенацией (ЭКМО) [47].В четырех рандомизированных контролируемых клинических испытаниях изучалась эффективность использования высоких доз легочного сурфактанта у доношенных или близких к родам детей с МАС. Мета-анализ исследований показал значительное снижение риска лечения ЭКМО по сравнению со стандартным лечением, хотя другие важные исходы, такие как смертность, утечка воздуха, БЛД и внутрижелудочковое кровотечение, не различались между двумя группами [48]. В двух испытаниях для лечения MAS использовалась стратегия промывания легких разбавленными сурфактантами.Мета-анализ этих двух испытаний показал, что эта стратегия значительно снижает комбинированный риск смерти или потребности в ЭКМО по сравнению с контрольной группой плацебо [49]. Однако другие важные клинические исходы существенно не различались между двумя группами, хотя общее количество младенцев, участвовавших в исследованиях, было небольшим. В недавнем сравнительном исследовании лаважа легких по сравнению с болюсной дозой сурфактанта на животной модели MAS первая группа (лаваж) продемонстрировала значительно улучшенные характеристики вентиляции и давления в легочной артерии [50].Эта терапия может принести пользу в будущем, как показывают результаты нерандомизированных исследований.

Группа B

Streptococcus Сепсис у новорожденных

Острый респираторный дистресс-синдром, вызванный стрептококковым сепсисом группы B (GBS), может вызывать дисфункцию сурфактанта по механизмам, аналогичным MAS. Кроме того, из-за воспалительного повреждения поверхности альвеолярного эпителия, приводящего к нарушению барьера между воздухом и жидкостью, происходит утечка жидкости (альвеолярный отек) и белков сыворотки в воздушное пространство.Как альвеолярный отек [51], так и сывороточные белки [52] могут способствовать инактивации сурфактанта и дисфункции. Эффективность заместительной терапии экзогенным сурфактантом при острой дыхательной недостаточности из-за сепсиса GBS изучалась в проспективном многоцентровом исследовании [53]. Лечение сурфактантом привело к быстрому снижению потребности в кислороде, хотя другие заболеваемость и смертность в целом были высокими.

Применение ПАВ у детей

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), вызванный острым повреждением легких у детей и подростков, может вызывать дисфункцию сурфактанта с помощью тех же механизмов, которые обсуждались выше.В большом РКИ по замещению экзогенного природного сурфактанта у детей с ОРДС авторы обнаружили значительное снижение потребности в кислороде и смертности в группе лечения по сравнению с контрольной группой плацебо [54]. Улучшение характеристик вентиляции было отмечено в нескольких нерандомизированных испытаниях терапии экзогенным сурфактантом у детей с ОРДС [55], хотя количество пациентов в каждом исследовании было небольшим. В целом, экзогенный сурфактант дает краткосрочные преимущества, хотя необходимы дальнейшие более масштабные исследования.

Бронхиолит — это распространенная респираторная респираторная инфекция младенцев и детей раннего возраста, наиболее частым патогеном которого является респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Небольшое количество пациентов с бронхиолитом прогрессирует до дыхательной недостаточности, нуждающейся в искусственной вентиляции легких. В трех небольших РКИ изучались эффекты замены экзогенного сурфактанта у детей с дыхательной недостаточностью, вызванной бронхиолитом. Мета-анализ исследований показал, что использование сурфактанта значительно сокращает продолжительность пребывания на ИВЛ и интенсивной терапии; и улучшенные характеристики вентиляции (оксигенация и удаление углекислого газа) [56].Однако из-за небольшого числа младенцев, включенных в испытания, это остается экспериментальной терапией для лечения дыхательной недостаточности при бронхиолите.

Таким образом, наиболее распространенное и наиболее изученное применение сурфактантов — это RDS у недоношенных новорожденных. Остаются некоторые разногласия относительно использования сурфактантов в этой популяции, включая время приема первой дозы, показания для многократных доз и использование новых синтетических препаратов сурфактанта (таблица 1) [57].Поверхностно-активные вещества использовались по другим показаниям у новорожденных и детей и дали краткосрочный эффект. Однако необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли сурфактантов при заболеваниях, не связанных с РДС.

Таблица 1 Источники и компоненты легочных сурфактантов

Генетические дефекты белков ПАВ

Из четырех известных белков сурфактанта гидрофобные SP-B и SP-C необходимы для нормальной функции сурфактанта в легких. Хотя он не участвует напрямую в снижении поверхностной активности, другой белок, который был идентифицирован на ограничивающей мембране ламеллярных телец, представляет собой аденозинтрифосфат-связывающую кассету A3 (ABCA3) [58].Считается, что ABCA3 является внутриклеточным переносчиком липидных молекул сурфактанта в ламеллярные тела. Фактор транскрипции щитовидной железы (TTF) -1 участвует в развитии легких и экспрессии сурфактантных белков в течение жизни плода [59]. Таким образом, генетические мутации гена TTF-1 NKX2.1 могут приводить к заболеваниям легких у новорожденных, имитирующих RDS.

Среди всех известных генетических заболеваний метаболизма сурфактантов дефекты SP-B изучены лучше всего. Хотя более 30 мутаций было идентифицировано в SFTPB , наиболее распространенной из них является замена трех оснований, GAA, на C в кодоне 121 экзона 4.Это называется 121ins2, и на его долю приходится около 70% мутаций, приводящих к дефициту SP-B [60]. Было идентифицировано несколько других мутаций, каждая из которых приводит к потере функции гена [61]. Наилучшая оценка частоты мутации 121ins2 в популяции составляет 1 на 1000–3000 [62], что позволяет предположить, что общая частота любой мутации составляет примерно 1 на 600–1800. Поскольку любой дефицит SP-B является аутосомно-рецессивным, прогнозируемая частота этого расстройства очень редка. Описаны мутации, приводящие к частичному дефициту SP-B, которые приводят к хроническим заболеваниям [61].Замена сурфактанта приводит к небольшому улучшению клинического статуса, но это кратковременное явление [61].

Хотя SP-C тесно участвует в метаболизме сурфактанта в легких, мутации SFTPC обычно не приводят к тяжелому фенотипу. Мутации обычно наследуются доминантным образом, и их частота неизвестна. Дефицит SP-C был связан с интерстициальным заболеванием легких (ILD) у детей [63].

Другой дефицит белка, приводящий к дисфункции сурфактанта, — это дефицит ABCA3.Хотя точная функция этого белка еще не установлена, мутаций гена ABCA3 и были идентифицированы у новорожденных с тяжелым заболеванием легких и дефицитом сурфактанта [64]. Присутствие аномальных пластинчатых тел у этих младенцев предполагает роль ABCA3 как белка-переносчика. Сообщалось о нескольких мутациях для ABCA3 , при этом замена валина на глутаминовую кислоту в кодоне 292 была идентифицирована как наиболее распространенная [65]. Тяжелая неонатальная гипоксическая дыхательная недостаточность является обычным фенотипом дефицита ABCA3 [64], хотя известно и более хроническое течение ILD [61].

Сообщалось, что доминантно экспрессируемые мутации NKX2.1 вызывают синдром, включающий хореоатетоз, гипотиреоз и хроническое поражение легких (респираторный дистресс в период новорожденности или повторные инфекции в более позднем детстве) [66]. Респираторный компонент может варьироваться от острого неонатального RDS до хронического детского ILD. Было идентифицировано несколько мутаций, приводящих к большому разнообразию фенотипов [67].

Хотя несколько генетических дефектов, приводящих к недостаточности количества или функции сурфактантных белков, были идентифицированы, в настоящее время не существует специального лечения ни для одного из них.Недостатки SP-B являются наиболее серьезными и часто имеют плохой прогноз. Однако сообщалось о некоторых формах дефицита SP-B (сложные гетерозиготы и сплайс-мутации) с длительным выживанием [68, 69]. Проявление других генетических дефектов может быть клинически изменчивым. Трансплантация легких была выполнена при некоторых из этих заболеваний, и в результате 5-летняя выживаемость (рис. 4) составила около 50% [61, 70]. Однако трансплантация легких связана со многими осложнениями, поэтому ее следует проводить только в опытных специализированных центрах.

Рисунок 4

Трансплантация легких при дефиците белка сурфактанта. Отдаленные результаты трансплантации всего легкого у детей с наследственной недостаточностью белка сурфактанта. SP: сурфактантный белок; ABCA: кассета, связывающая аденозинтрифосфат. Воспроизведено из [70] с разрешения издателя.

Последние разработки и будущие тенденции

В настоящее время введение сурфактанта новорожденным и детям требует интубации и искусственной вентиляции легких.Поскольку это лечение чаще всего используется у недоношенных детей с риском или с установленным РДС, это становится инвазивной процедурой. Сама по себе искусственная вентиляция легких может привести к повреждению легких [71], и неинвазивные режимы вентиляции становятся все более распространенными [72]. Таким образом, апробируются менее инвазивные методы доставки сурфактанта. Впервые описанный в Германии [73], доставка сурфактанта через тонкий эндотрахеальный катетер у спонтанно дышащих младенцев, по-видимому, ограничивает потребность в ИВЛ и снижает частоту БЛД [74, 75].В одном из вариантов этого метода Dargaville et al. [76] доставлял сурфактант спонтанно дышащим младенцам в режиме CPAP (после премедикации) через сосудистый катетер. Хотя этот метод имеет теоретические преимущества, необходимы дальнейшие исследования в РКИ, чтобы прояснить клинические эффекты такой стратегии доставки сурфактанта.

Другой неинвазивный способ доставки сурфактанта — распыление. Было опубликовано несколько сообщений о применении распыляемого сурфактанта у недоношенных новорожденных со спонтанным дыханием [77].К сожалению, из-за значительных различий в используемых методах их нельзя сравнивать. Хотя распыление кажется выполнимой процедурой, необходимы дальнейшие исследования для стандартизации методов, доз, клинической эффективности и безопасности, прежде чем они будут внедрены в клиническую практику [78].

Заключение

Поверхностно-активные вещества представляют собой природные комплексы фосфолипидов и белков, которые присутствуют на границе раздела воздух-жидкость в легких и снижают поверхностное натяжение. Замена экзогенного сурфактанта у недоношенных детей — одно из самых значительных достижений в неонатологии.Терапия экзогенным сурфактантом также может иметь значение при других респираторных заболеваниях новорожденных и детей старшего возраста, но для определения ее места требуется дополнительная работа. Также необходимы дальнейшие исследования новых методов его доставки, оптимального состава и сроков. Однако место этого вмешательства в медицине прочно закрепилось.

Образовательные вопросы

1. Молекула, наиболее подходящая для поверхностной активности на границе раздела воздух-жидкость в альвеолах:

   1. СП-Б

   2. PG

   3. DPPC

   4. сфингомиелин

   5. SP-A

2. Наиболее распространенное применение экзогенного сурфактанта у людей:

   1. ARDS

   2. RDS

   3. MAS

   4. стрептококковый сепсис группы В

   5. бронхиолит

3. В настоящее время лучшее время для замены сурфактанта у недоношенных новорожденных с неонатальным РДС:

   1. — до начала РДС (профилактическое)

   2. находится в начале RDS (раннее спасение)

   3. — только когда RDS ухудшается с увеличением требований к вентиляции (позднее спасение)

   4. никогда, так как замена ПАВ не указана в RDS

   5. остается спорным, и тема исследования

4. Согласно текущим исследованиям, что из следующего является наиболее эффективным заместителем экзогенного сурфактанта для неонатального RDS?

   1. Порактант альфа

   2. Эндогенный человеческий (из околоплодных вод)

   3. Колфосерил

   4. Люсинактант

Ответы на учебные вопросы

1. с

2. б

3. e

4. а

Примеры гомогенных смесей: твердые, жидкие и газовые

В химии смеси подразделяются на две общие категории: гетерогенные смеси и гомогенные смеси.Мы подробно рассмотрели гетерогенные смеси прямо здесь, но как насчет гомогенных смесей? Гомогенная смесь — это любая смесь, однородная по составу. Пока каждое вещество смешано в достаточном количестве, чтобы его нельзя было отличить от других, это однородная смесь.

Общие сведения об однородных смесях

Один из самых интересных фактов о гетерогенных и гомогенных смесях заключается в том, что в определенном смысле нет реального различия. Присмотритесь к любому веществу, даже к чистому элементу, и оно станет неоднородным, потому что состоит из разных субатомных частиц.И наоборот, в достаточно большом масштабе все во Вселенной однородно, потому что становится невозможным различать компоненты.

Свойства гомогенных смесей лучше всего определять по шкале где-то между ними. Ученые (и мы) чаще всего используют простой стандарт невооруженного глаза. Если можно увидеть, что вещество содержит два или более отдельных компонента, оно считается неоднородным. Если кажется, что это всего лишь одно однородное вещество, оно однородное.

Вот несколько примеров однородных смесей.

Твердые однородные смеси

Существует широкий спектр твердых однородных смесей, от природных материалов, таких как камень, до синтетических пластмасс.

• Битум, твердая форма нефти и источник бензина, дизельного топлива и других ископаемых видов топлива, представляет собой гомогенную смесь сложных углеводородных химических веществ.
• Цемент представляет собой твердую однородную смесь соединений кальция. Смешанный с песком, гравием и водой, он становится бетоном, одним из важнейших строительных материалов в мире.
• Многие сплавы представляют собой гомогенные смеси металлов или металла и неметаллического вещества. Бронза, которую делают из меди и олова, является примером сплава первого типа. Сталь, сделанная из железа и углерода, является примером второго.
• Пластмассы — одни из самых важных гомогенных смесей в мире. Открытие того, что определенные смеси синтетических органических соединений могут быть превращены в твердые объекты, изменило всю обрабатывающую промышленность.
• Древесина представляет собой однородную смесь.Компоненты, из которых состоит живая древесина, бывают твердыми, жидкими и газообразными, но все они метаболизируются деревом в твердую древесину.

Жидкие гомогенные смеси

Многие жидкости, с которыми вы сталкиваетесь каждый день — в действительности, большинство жидкостей, питающих ваше тело, — являются примерами гомогенных смесей.

• В организме человека плазма крови является примером гомогенной смеси. Бесцветная жидкость удерживает клетки крови во взвешенном состоянии. Он составляет чуть более половины объема крови человека.
• Молоко — однородный коллоид. Коллоиды — это смеси, состоящие из крошечных нерастворимых капель, плавающих в растворителе. Некоторые источники говорят, что коллоиды по определению неоднородны, но невооруженным глазом молоко представляет собой однородную жидкую суспензию жиров в воде.
• Большинство вин и спиртных напитков представляют собой однородные смеси. Наука о производстве вина и ликеров основана на использовании этанола и / или воды в качестве растворителя для различных веществ — например, обугленного дуба для виски из бурбона или можжевельника в джине — для создания уникальных ароматов.
• Сама вода является примером гомогенной смеси. Вся вода, кроме самой чистой, содержит растворенные минералы и газы. Они растворены в воде, поэтому смесь находится в одной и той же фазе и является однородной.
• Жидкое средство для стирки — еще один пример однородной смеси различных мыл и химикатов для стирки одежды.

Газообразные однородные смеси

Многие из наиболее часто встречающихся газообразных веществ, с которыми сталкиваются люди, в том числе самое распространенное, воздух, являются однородными смесями.

• Воздух, которым вы дышите, представляет собой однородную смесь кислорода, азота, аргона и углекислого газа, а также других элементов в меньших количествах. Поскольку каждый слой атмосферы Земли имеет разную плотность, каждый слой воздуха представляет собой собственную однородную смесь.
• Природный газ — это газообразная гетерогенная смесь метана и других углеводородов, используемая в качестве топлива.
• Так называемые «неоновые вывески» на самом деле используют ряд различных элементарных газов и гомогенных газовых смесей для создания своего фирменного свечения.Например, пары аргона и ртути создают яркий синий цвет.
• Закись азота — одна из многих газообразных гомогенных смесей, используемых для анестезии. В качестве обезболивающего используется закись азота в растворе 50/50 с кислородом. На самом деле врачи в просторечии называют закись азота «газом и воздухом»!

• В подводном плавании с аквалангом используется несколько однородных смесей газов, таких как гелиокс и тримикс.

Вещество смесей

Понимание гомогенных и гетерогенных смесей жизненно важно для углубления ваших знаний в области химии.Примеры однородных смесей помогают раскрыть замечательные научные секреты, раскрывающие даже самые простые аспекты жизни. Чтобы узнать больше о химии от нас, ознакомьтесь с примерами насыщенных растворов, включая газированную воду и соленое масло. Удачного обучения!

Коллоиды | Химия

ЦЕЛИ ОБУЧЕНИЯ

К концу этого раздела вы сможете:

• Описать состав и свойства коллоидных дисперсий
• Перечислите и объясните несколько технологических применений коллоидов

В детстве вы могли делать суспензии, такие как смеси грязи и воды, муки и воды, или суспензии твердых пигментов в воде, известные как темперные краски.Эти суспензии представляют собой гетерогенные смеси, состоящие из относительно крупных частиц, которые видны (или которые можно увидеть в увеличительное стекло). Они мутные, а взвешенные частицы оседают после смешивания. С другой стороны, когда мы делаем раствор, мы готовим гомогенную смесь, в которой не происходит осаждения и в которой растворенные частицы представляют собой молекулы или ионы. Растворы ведут себя совершенно иначе, чем суспензии. Раствор может быть окрашен, но он прозрачен, молекулы или ионы невидимы, и они не оседают при стоянии.Группа смесей, называемых коллоидами (или коллоидными дисперсиями ), проявляет свойства, промежуточные между свойствами суспензий и растворов (рис. 1). Частицы в коллоиде больше, чем большинство простых молекул; однако коллоидные частицы достаточно малы, поэтому они не оседают при стоянии.

Рис. 1. (a) Раствор представляет собой однородную смесь, которая кажется прозрачной, как, например, соленая вода в этом аквариуме. (б) В коллоиде, таком как молоко, частицы намного крупнее, но остаются диспергированными и не оседают.(c) Суспензия, такая как грязь, представляет собой гетерогенную смесь взвешенных частиц, которая кажется мутной и в которой частицы могут оседать. (кредит фото: модификация работы Адама Вимсатта; кредит b фото: модификация работы Мелиссы Визе; кредит c фото: модификация работы Питера Берджесса)

Частицы в коллоиде достаточно велики, чтобы рассеивать свет. Это явление называется эффектом Тиндаля . Это может сделать коллоидные смеси мутными или непрозрачными, как, например, луч прожектора, показанный на рисунке 2.Облака — это коллоидные смеси. Они состоят из капель воды, которые намного крупнее молекул, но достаточно малы, чтобы не оседать.

Рис. 2. Пути лучей прожекторов становятся видимыми, когда свет рассеивается частицами коллоидного размера в воздухе (туман, дым и т. Д.). (Источник: «Бахман» / Википедия)

Термин «коллоид» — от греческих слов kolla , что означает «клей», и eidos , что означает «подобное», был впервые использован в 1861 году Томасом Грэхемом для классификации смесей, таких как водный крахмал и желатин.Многие коллоидные частицы представляют собой агрегаты из сотен или тысяч молекул, но другие (например, белки и молекулы полимеров) состоят из одной чрезвычайно большой молекулы. Молекулы белков и синтетических полимеров, образующие коллоиды, могут иметь молекулярные массы в диапазоне от нескольких тысяч до многих миллионов атомных единиц массы.

Аналогично идентификации компонентов раствора как «растворенное вещество» и «растворитель», компоненты коллоида также классифицируются в соответствии с их относительными количествами.Компонент в виде частиц, обычно присутствующий в относительно небольшом количестве, называется дисперсной фазой , а вещество или раствор, в котором диспергированы частицы, называют дисперсионной средой . Коллоиды могут включать практически любую комбинацию физических состояний (газ в жидкости, жидкость в твердом состоянии, твердое тело в газе и т. Д.), Как показано на примерах коллоидных систем, приведенных в таблице 1.

Таблица 1. Примеры коллоидных систем
Дисперсная фаза	Средняя дисперсия	Общие примеры	Имя
цельный	газ	дым, пыль	–
цельный	жидкость	крахмал в воде, некоторые чернила, краски, молоко магнезиальное	соль
цельный	цельный	некоторые цветные камни, некоторые сплавы	–
жидкость	газ	облака, туманы, туманы, брызги	аэрозоль
жидкость	жидкость	молоко, майонез, масло сливочное	эмульсия
жидкость	цельный	желе, гели, жемчуг, опал (H 2 O в SiO 2 )	гель
газ	жидкость	пены, сливки взбитые, белки взбитые	пена
газ	цельный	пемза, плавающее мыло	–

Приготовление коллоидных систем

Мы можем приготовить коллоидную систему, производя частицы коллоидных размеров и распределяя эти частицы в дисперсионной среде.Частицы коллоидного размера образуются двумя способами:

1. Методы диспергирования: то есть путем разрушения более крупных частиц. Например, красящие пигменты получают путем диспергирования крупных частиц путем измельчения в специальных мельницах.
2. Методы конденсации: то есть рост из более мелких единиц, таких как молекулы или ионы. Например, облака образуются, когда молекулы воды конденсируются и образуют очень маленькие капли.

Некоторые твердые вещества при контакте с водой самопроизвольно диспергируются и образуют коллоидные системы.Таким образом ведут себя желатин, клей, крахмал и сухое обезвоженное молоко. Частицы уже имеют коллоидный размер; вода их просто разгоняет. Частицы сухого молока коллоидного размера получают путем обезвоживания молока спреем. Некоторые распылители производят коллоидные дисперсии жидкости в воздухе.

Мы можем приготовить эмульсию путем встряхивания или смешивания двух несмешивающихся жидкостей. Это разбивает одну жидкость на капли коллоидного размера, которые затем рассеиваются в другой жидкости.Разливы нефти в океане может быть трудно очистить отчасти потому, что воздействие волн может привести к образованию эмульсии из нефти и воды. Однако во многих эмульсиях дисперсная фаза имеет тенденцию коалесцировать, образовывать большие капли и разделяться. Поэтому эмульсии обычно стабилизируются эмульгатором , веществом, которое ингибирует слипание диспергированной жидкости. Например, немного мыла стабилизирует эмульсию керосина в воде. Молоко представляет собой эмульсию молочного жира в воде с протеиновым казеином в качестве эмульгатора.Майонез представляет собой эмульсию масла в уксусе с компонентами яичного желтка в качестве эмульгаторов.

Методы конденсации образуют коллоидные частицы путем агрегации молекул или ионов. Если частицы вырастают за пределы диапазона коллоидных размеров, образуются капли или осадки, и коллоидная система не образуется. Облака образуются, когда молекулы воды объединяются и образуют частицы размером с коллоид. Если эти частицы воды сливаются с образованием достаточно крупных капель жидкой воды или кристаллов твердой воды, они оседают с неба в виде дождя, мокрого снега или снега.{-} \ rightarrow \ text {Au} [/ latex]

Некоторые золи золота, полученные в 1857 г., все еще не повреждены (частицы не слиплись и не осели), что свидетельствует о долговременной стабильности многих коллоидов.

Мыло и моющие средства

Первопроходцы сделали мыло путем кипячения жиров с сильно щелочным раствором, полученным путем выщелачивания карбоната калия, K ₂ CO ₃ , из древесной золы горячей водой. Животные жиры содержат сложные полиэфиры жирных кислот (длинноцепочечные карбоновые кислоты). Когда животные жиры обрабатываются основанием, таким как карбонат калия или гидроксид натрия, образуются глицерин и соли жирных кислот, таких как пальмитиновая, олеиновая и стеариновая кислоты.{-} [/ latex] (Рисунок 4). Мыло образуют в жесткой воде нерастворимые соединения кальция и магния; моющие средства образуют водорастворимые продукты — несомненное преимущество моющих средств.

Рис. 4. Моющие средства содержат неполярный углеводородный конец (синий) и ионный конец (красный). Ионный конец может быть сульфатом или сульфонатом. Длина углеводородного конца может варьироваться от моющего средства к моющему средству.

Очищающее действие мыла и моющих средств можно объяснить структурами участвующих в нем молекул.Углеводородный (неполярный) конец молекулы мыла или моющего средства растворяется в неполярных веществах, таких как масло, жир или частицы грязи, или притягивается к ним. Ионный конец притягивается водой (полярной), как показано на рисунке 5. В результате молекулы мыла или детергента ориентируются на границе раздела между частицами грязи и водой, так что они действуют как своего рода мост между двумя различными типами материя, неполярная и полярная. Такие молекулы называются амфифильными , поскольку они имеют как гидрофобную («водобоязненную») часть, так и гидрофильную («водоотталкивающую») часть.Как следствие, частицы грязи становятся взвешенными в виде коллоидных частиц и легко вымываются.

Рис. 5. На этом схематическом разрезе эмульгированной капли масла в воде показано, как мыло или детергент действуют как эмульгатор.

Разлив нефти Deepwater Horizon

В результате прорыва нефтяной буровой установки Deepwater Horizon 20 апреля 2010 года в Мексиканском заливе недалеко от Миссисипи начался крупнейший морской разлив нефти в истории нефти. В течение 87 дней после выброса, по оценкам, 4.9 миллионов баррелей (210 миллионов галлонов) нефти вытекло из прорвавшейся скважины на 5000 футов ниже поверхности воды. 19 сентября 2010 г. скважина была окончательно объявлена ​​закрытой.

Сырая нефть не смешивается с водой и имеет меньшую плотность, поэтому разлитая нефть поднялась на поверхность воды. Плавучие боны, скиммеры и контролируемые ожоги использовались для удаления нефти с поверхности воды в попытке защитить пляжи и водно-болотные угодья вдоль побережья Персидского залива. В дополнение к удалению нефти, были также предприняты попытки уменьшить ее воздействие на окружающую среду, сделав ее «растворимой» (в широком смысле этого слова) и, таким образом, позволив разбавить ее до, надеюсь, менее вредного уровня огромным объемом океана. вода.В этом подходе использовалось 1,84 миллиона галлонов диспергатора нефти Corexit 9527, большая часть которого была закачана под воду в месте утечки, а небольшие количества были распылены на поверхность разлива. Corexit 9527 содержит 2-бутоксиэтанол (C ₆ H ₁₄ O ₂ ), амфифильную молекулу, полярные и неполярные концы которой используются для эмульгирования масла в маленькие капли, увеличивая площадь поверхности масла и делая его более доступным. морским бактериям для пищеварения (рис. 6).Хотя этот подход позволяет избежать многих непосредственных опасностей, которые нефть в больших объемах представляет для морских и прибрежных экосистем, он вводит возможность долгосрочных последствий в результате попадания сложных и потенциально токсичных компонентов нефти в пищевую цепь океана. Ряд организаций вовлечены в мониторинг расширенного воздействия этого разлива нефти, в том числе Национальное управление океанических и атмосферных исследований (для получения дополнительных сведений посетите веб-сайт NOAA Gulf Spill Restoration).

Рис. 6. (a) На этом спутниковом снимке НАСА показано нефтяное пятно от разлива Deepwater Horizon. (b) Самолет ВВС США распыляет диспергатор корексит. (c) Показана молекулярная структура 2-бутоксиэтанола. (кредит А: модификация работы «НАСА, FT2, demis.nl» / Wikimedia Commons; кредит б: модификация работы «НАСА / MODIS Rapid Response Team» / Википедия)

Электрические свойства коллоидных частиц

Дисперсные коллоидные частицы часто имеют электрический заряд.Коллоидная частица гидроксида железа (III), например, не содержит достаточного количества гидроксид-ионов, чтобы точно компенсировать положительные заряды на ионах железа (III). Таким образом, каждая отдельная коллоидная частица несет положительный заряд, а коллоидная дисперсия состоит из заряженных коллоидных частиц и некоторых свободных гидроксид-ионов, которые поддерживают электрическую нейтральность дисперсии. Большинство коллоидов гидроксидов металлов имеют положительный заряд, тогда как большинство металлов и сульфидов металлов образуют отрицательно заряженные дисперсии.Все коллоидные частицы в любой системе имеют заряды одного знака. Это помогает им оставаться рассредоточенными, поскольку частицы, содержащие одинаковые заряды, отталкиваются друг от друга.

Мы можем использовать заряд коллоидных частиц, чтобы удалить их из множества смесей. Если мы поместим коллоидную дисперсию в контейнер с заряженными электродами, положительно заряженные частицы, такие как частицы гидроксида железа (III), переместятся к отрицательному электроду. Здесь коллоидные частицы теряют свой заряд и коагулируют в виде осадка.

Частицы углерода и пыли в дыме часто коллоидно диспергированы и электрически заряжены. Фредерик Коттрелл, американский химик, разработал способ удаления этих частиц.

Портрет химика: Фредерик Гарднер Коттрелл

Рис. 7 Фредерик Коттрелл (а) разработал электрофильтр (б), устройство, предназначенное для ограничения загрязнения воздуха путем удаления из него коллоидных частиц. (кредит b: модификация работы «SpLot» / Wikimedia Commons)

Фредерик Коттрелл родился в 1877 году в Окленде, Калифорния, «читал учебники как романы» и окончил среднюю школу в возрасте 16 лет.Затем он поступил в Калифорнийский университет (UC) в Беркли, получив за три года степень бакалавра. Он сэкономил деньги из своей годовой зарплаты 1200 долларов в качестве учителя химии в Оклендской средней школе, чтобы профинансировать учебу по химии в Берлине у лауреата Нобелевской премии Якоба Хенрикуса Вант Хоффа и в Лейпциге у Вильгельма Оствальда, еще одного лауреата Нобелевской премии. Получив докторскую степень по физической химии, он вернулся в Соединенные Штаты, чтобы преподавать в Калифорнийском университете в Беркли. Он также консультировал компанию DuPont, где он разработал электрофильтр — устройство, предназначенное для ограничения загрязнения воздуха путем удаления из него коллоидных частиц.Коттрелл использовал выручку от своего изобретения для финансирования некоммерческой исследовательской корпорации для финансирования научных исследований.

Заряженные частицы притягиваются к сильно заряженным электродам, где они нейтрализуются и осаждаются в виде пыли (рис. 8). Это один из важных методов, используемых для очистки от дыма в различных производственных процессах. Этот процесс также важен для извлечения ценных продуктов из дыма и дымовой пыли плавильных печей, печей и обжиговых печей. Существуют также ионные воздушные фильтры, предназначенные для домашнего использования для улучшения качества воздуха в помещении.

Рис. 8. (a) В осадителе Коттрелла положительно и отрицательно заряженные частицы притягиваются к сильно заряженным электродам, где они нейтрализуются и осаждаются в виде пыли. (b) Современный электрофильтр с эффективной конструкцией сотового электрода, устанавливаемый на мусоросжигательном заводе.

Гели

Когда мы производим желатин, такой как Jell-O, мы производим коллоид (рис. 9). Желатин застывает при охлаждении, потому что горячая водная смесь желатина коагулирует при охлаждении, и вся масса, включая жидкость, превращается в чрезвычайно вязкое тело, известное как гель, коллоид, в котором диспергирующая среда является твердой, а дисперсная фаза — твердой. жидкость.Похоже, что волокна диспергирующей среды образуют сложную трехмерную сеть, пустоты которой заполняются жидкой средой или разбавленным раствором диспергирующей среды. Поскольку образование геля сопровождается поглощением воды или другого растворителя, говорят, что гель гидратирован или сольватирован.

Рис. 9. Желатиновые десерты представляют собой коллоид, потому что диспергирующая среда является твердой, но в дисперсной фазе это жидкость. (кредитное фото: модификация работы Стивена Деполо)

Пектин, углевод из фруктовых соков, представляет собой гелеобразующее вещество, важное для приготовления желе.Силикагель, коллоидная дисперсия гидратированного диоксида кремния, образуется при добавлении разбавленной соляной кислоты к разбавленному раствору силиката натрия. Canned Heat — это гель, полученный путем смешивания спирта и насыщенного водного раствора ацетата кальция.

Основные понятия и краткое изложение

Коллоиды — это смеси, в которых одно или несколько веществ диспергированы в виде относительно крупных твердых частиц или жидких капель в твердой, жидкой или газообразной среде. Частицы коллоида остаются диспергированными и не оседают под действием силы тяжести, и они часто имеют электрический заряд.Коллоиды широко распространены в природе и используются во многих технологических приложениях.

Химия: упражнения в конце главы

1. Определите дисперсную фазу и дисперсионную среду в каждой из следующих коллоидных систем: дисперсия крахмала, дым, туман, жемчуг, взбитые сливки, плавающее мыло, желе, молоко и рубин.
2. Различают методы диспергирования и методы конденсации для приготовления коллоидных систем.
3. Чем коллоиды отличаются от растворов в отношении размера дисперсных частиц и однородности?
4. Объясните очищающее действие мыла.
5. Как можно продемонстрировать, что коллоидные частицы электрически заряжены?

Избранные ответы

1.

Коллоидная система	Дисперсная фаза	Средняя дисперсия
крахмальная дисперсия	крахмал	вода
дым	твердых частиц	воздух
туман	вода	воздух
жемчуг	вода	карбонат кальция (CaCO 3 )
сливки взбитые	воздух	крем
плавающее мыло	воздух	мыло
желе	фруктовый сок	пектиновый гель
молоко	жир	вода
рубин	оксид хрома (III) (Cr 2 O 3 )	оксид алюминия (Al 2 O 3 )

3.Коллоидные дисперсии состоят из частиц, которые намного больше, чем растворенные вещества в типичных растворах. Коллоидные частицы — это либо очень большие молекулы, либо агрегаты более мелких частиц, которые обычно достаточно велики, чтобы рассеивать свет. Коллоиды гомогенны в макроскопическом (визуальном) масштабе, а растворы гомогенны в микроскопическом (молекулярном) масштабе.

5. Если их поместить в электролитическую ячейку, диспергированные частицы будут двигаться к электроду, несущему заряд, противоположный их собственному заряду.На этом электроде заряженные частицы нейтрализуются и коагулируют в виде осадка.

Глоссарий

амфифильные
молекулы, обладающие как гидрофобной (неполярной), так и гидрофильной (полярной) частями

коллоидная
(также коллоидная дисперсия) смесь, в которой относительно крупные твердые или жидкие частицы равномерно диспергированы в газе, жидкости или твердом теле

дисперсионная среда
твердое тело, жидкость или газ, в котором диспергированы коллоидные частицы

дисперсная фаза
вещество, присутствующее в виде относительно крупных твердых или жидких частиц в коллоиде

эмульгатор
амфифильное вещество, используемое для стабилизации частиц некоторых эмульсий

эмульсия
коллоид, образованный из несмешивающихся жидкостей

гель
коллоидная дисперсия жидкости в твердом веществе

Эффект Тиндаля
Рассеяние видимого света коллоидной дисперсией

Дисфункция сурфактанта: MedlinePlus Genetics

Дисфункция сурфактанта вызвана мутациями в одном из нескольких генов, включая SFTPB , SFTPC и ABCA3 .Каждый из этих генов участвует в производстве сурфактанта. Производство и выпуск поверхностно-активного вещества — сложный процесс. Фосфолипиды и белки, из которых состоит сурфактант, упакованы в клеточные структуры, известные как ламеллярные тела. Эти структуры также важны для некоторой обработки белков поверхностно-активных веществ, которая необходима для созревания белков и их функционирования. Поверхностно-активное вещество высвобождается из клеток легких и распространяется по ткани, окружающей альвеолы. Это вещество снижает поверхностное натяжение, что предотвращает схлопывание альвеол после выдоха и облегчает дыхание.

Гены SFTPB и SFTPC предоставляют инструкции по созданию сурфактантного белка-B (SP-B) и сурфактантного белка-C (SP-C), соответственно, двух из четырех белков в сурфактанте. Эти два белка помогают распределить сурфактант по поверхности легочной ткани, способствуя снижению поверхностного натяжения сурфактанта. Кроме того, SP-B играет роль в формировании пластинчатых тел.

Мутации в гене SFTPB вызывают тип дисфункции сурфактанта, иногда называемый дефицитом SP-B.Эти мутации приводят к снижению или отсутствию зрелого SP-B. Кроме того, мутации гена SFTPB вызывают аномальный процессинг SP-C, что приводит к отсутствию зрелого SP-C и накоплению необработанных форм SP-C. Эти изменения приводят к ненормальному составу поверхностно-активного вещества и снижению функции поверхностно-активного вещества. Потеря функционального сурфактанта увеличивает поверхностное натяжение в альвеолах, вызывая серьезные проблемы с дыханием. Комбинация дисфункции SP-B и SP-C может объяснить, почему признаки и симптомы дефицита SP-B настолько серьезны.

Мутации в гене SFTPC вовлечены в тип дисфункции сурфактанта, иногда называемый дисфункцией SP-C. Эти мутации приводят к снижению или отсутствию зрелого SP-C и накоплению аномальных форм SP-C. Неясно, какой из этих исходов вызывает признаки и симптомы дисфункции SP-C. Отсутствие зрелого SP-C может привести к ненормальному составу сурфактанта и снижению функции сурфактанта. С другой стороны, исследования показывают, что аномально обработанные белки SP-C образуют неправильную трехмерную форму и накапливаются внутри клеток легких.Эти неправильно свернутые белки могут вызывать клеточный ответ, который приводит к повреждению и гибели клеток. Это повреждение может нарушить выработку и высвобождение поверхностно-активного вещества.

Ген ABCA3 предоставляет инструкции по созданию белка, который находится в мембране, окружающей ламеллярные тела. Белок ABCA3 переносит фосфолипиды в пластинчатые тела, где они образуют сурфактант. Белок ABCA3, по-видимому, также участвует в образовании ламеллярных телец.

Мутации гена ABCA3 , которые вызывают тип дисфункции сурфактанта, иногда называемый дефицитом ABCA3, приводят к снижению или отсутствию функции белка.Без функции белка ABCA3 транспорт фосфолипидов сурфактанта снижается. Кроме того, нарушается формирование пластинчатого тела, что вызывает ненормальную обработку SP-B и SP-C. Мутации гена ABCA3 приводят к аномальному составу и функции сурфактанта. Было высказано предположение, что мутации, которые устраняют функцию белка ABCA3, вызывают тяжелые формы дисфункции сурфактанта, а мутации, которые оставляют некоторую остаточную активность ABCA3, вызывают более легкие формы состояния.

Развитие кишечной микробиоты ребенка

Abstract

Почти сразу после рождения человека возникает новая микробная экосистема, которая находится в желудочно-кишечном тракте этого человека.Несмотря на то, что это универсальная и неотъемлемая часть биологии человека, временное развитие этого процесса, источники микробов, составляющих экосистему, как и почему она меняется от одного младенца к другому, и как состав этой экосистемы влияет на человека. физиология, развитие и болезни все еще плохо изучены. В качестве шага к систематическому исследованию этих вопросов мы разработали микроматрицу для обнаружения и количественного определения последовательностей генов малых субъединиц рибосомной РНК (SSU рРНК) большинства известных в настоящее время видов и таксономических групп бактерий.Мы использовали этот микрочип вместе с секвенированием клонированных библиотек рДНК SSU, амплифицированных с помощью ПЦР, для профилирования микробных сообществ в среднем по 26 образцам стула от 14 здоровых доношенных новорожденных, включая пару дизиготных близнецов, начиная с первый стул после рождения и продолжающийся через определенные промежутки времени в течение первого года жизни. Чтобы исследовать возможное происхождение детской микробиоты, мы также составили профили вагинальных образцов и молока от большинства матерей, а также образцов кала от всех матерей, большинства отцов и двух братьев и сестер.Состав и временные паттерны микробных сообществ широко варьировались от ребенка к ребенку. Несмотря на значительные временные различия, отличительные черты микробного сообщества каждого ребенка можно было распознать в течение нескольких недель или месяцев. Поразительно параллельные временные паттерны близнецов предполагают, что случайные воздействия окружающей среды играют важную роль в определении отличительных характеристик микробного сообщества каждого ребенка. К концу первого года жизни идиосинкразические микробные экосистемы у каждого ребенка, хотя и различны, сходились к профилю, характерному для желудочно-кишечного тракта взрослого.

Информация об авторе

Уже почти столетие было признано, что люди населены удивительно плотной и разнообразной микробной экосистемой, но мы только начинаем понимать и ценить многие роли, которые эти микробы играют в здоровье и развитии человека. Знание состава этой экосистемы — решающий шаг к пониманию ее роли. В этом исследовании мы разработали и применили подход на основе микрочипов рибосомальной ДНК для отслеживания развития кишечной флоры у 14 здоровых доношенных детей в течение первого года жизни.Мы обнаружили, что состав и временные паттерны микробных сообществ широко варьировались от ребенка к ребенку, поддерживая более широкое определение здоровой колонизации, чем считалось ранее. К одному году младенцы сохранили свою уникальность, но приблизились к профилю, характерному для желудочно-кишечного тракта взрослого человека. Состав и временные паттерны развития кишечной микробиоты у пары разнояйцевых близнецов были поразительно похожи, что позволяет предположить, что генетические факторы и факторы окружающей среды формируют нашу кишечную микробиоту воспроизводимым образом.

Образец цитирования: Палмер С., Бик Е.М., ДиДжиулио Д.Б., Релман Д.А., Браун П.О. (2007) Развитие кишечной микробиоты у младенцев человека. PLoS Biol 5 (7): e177. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177

Академический редактор: Иджун Руан, Институт генома Сингапура, Сингапур

Поступила: 22 января 2007 г .; Принята к печати: 4 мая 2007 г .; Опубликован: 26 июня 2007 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями декларации Creative Commons Public Domain, которая предусматривает, что после размещения в общественном достоянии эта работа может свободно воспроизводиться, распространяться, передаваться, модифицированы, созданы на основе или иным образом использованы кем-либо в законных целях.

Финансирование: Эта работа финансировалась Фондом Хорна и Медицинским институтом Говарда Хьюза.

Конкурирующие интересы: ПОБ — исследователь Медицинского института Говарда Хьюза.

Сокращения: GI, желудочно-кишечный тракт; нт, нуклеотид; ОТУ, оперативная таксономическая единица; prokMSA, выравнивание множественных прокариотических последовательностей; КПЦР, количественная ПЦР; рДНК, рибосомная ДНК; рРНК, рибосомная РНК; СГУ, г. малая единица

Введение

Тело взрослого человека обычно содержит в десять раз больше микробных клеток, чем человеческих клеток, в основном из-за чрезвычайно высокой плотности микробов, обнаруженных в кишечном тракте человека (обычно 10 ¹¹ –10 ¹² микробов / мл просвета. содержание).Эта микробная экосистема выполняет множество важных функций для своего хозяина-человека, включая защиту от патогенов, обработку питательных веществ, стимуляцию ангиогенеза и регулирование накопления жира в организме хозяина [1–7]. Понятно, что этот список еще не полный; по мере расширения этой области исследований мы постоянно открываем для себя новые роли и отношения. Исследования на мышах-гнотобиотах были особенно полезными, демонстрируя важную роль микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в нормальном развитии кишечника [2,5].Кроме того, многие заболевания как у взрослых, так и у младенцев имеют известную или предполагаемую связь с микробиотой желудочно-кишечного тракта, включая рак желудка [8], лимфому лимфоидной ткани слизистой оболочки [9], воспалительное заболевание кишечника [10,11] и некротический энтероколит [ 12,13].

Состав микробиоты ЖКТ взрослых был интенсивно изучен с использованием как культивирования, так и, в последнее время, методов на основе последовательности малых субъединиц (SSU) рибосомной ДНК (рДНК), не зависящих от культуры [14]. Одна только экосистема толстой кишки человека насчитывает более 400 видов бактерий, принадлежащих к ограниченному числу широких таксономических подразделений [15].Представители анаэробных родов Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, и Faecalibacterium , как правило, составляют большую часть микробного сообщества кишечника взрослых людей. Тем не менее, кишечник каждого взрослого человека, по-видимому, имеет уникальное микробное сообщество со структурой, которая остается стабильной в течение нескольких месяцев [3,15,16].

Напротив, микробиота желудочно-кишечного тракта младенцев более изменчива по своему составу и менее стабильна с течением времени. На первом году жизни кишечный тракт младенца прогрессирует от бесплодия к чрезвычайно плотной колонизации, заканчиваясь смесью микробов, которая в целом очень похожа на микробы, обнаруженные в кишечнике взрослого человека [17].Хотя начальная и конечная точки этого временного отрезка хорошо определены, путь между этими точками плохо понят. В литературе есть противоречивые сообщения о составе микробиоты ЖКТ новорожденных и факторах, которые его формируют. В нескольких исследованиях сообщалось, что бифидобактерии почти всегда доминируют в микробиоте ЖКТ грудных детей к возрасту нескольких недель [17–20], в то время как другие обнаружили, что они встречаются только у небольшой части младенцев или численно не доминируют [21, 22].Влияние диеты на состав микробиоты желудочно-кишечного тракта младенцев также является спорным — многочисленные исследования показали более низкую численность бифидобактерий и более высокую численность аэробных бактерий в микробиоте желудочно-кишечного тракта младенцев, вскармливаемых смесью, по сравнению с младенцами на грудном вскармливании [ 20,21,23–25], однако в других отчетах такой разницы не обнаружено [26,27]. Способ доставки часто упоминается как один из ключевых факторов, формирующих микробиоту младенца [18,28,29]. Сообщалось, что микробиота желудочно-кишечного тракта младенцев, рожденных с помощью кесарева сечения, отличается от микробиоты младенцев, рожденных естественным путем, как по времени колонизации, так и по составу [18,30–32], а в некоторых случаях имеются явные следы материнского микробиота влагалища в микробиоте желудочно-кишечного тракта новорожденных [33], однако относительная важность способа доставки для микробиоты желудочно-кишечного тракта неясна.Из-за увеличения частоты проблем с желудочно-кишечным трактом у недоношенных детей, влияние гестационного возраста также широко изучалось. Эти исследования неизменно показывают, что микробиота госпитализированных недоношенных детей отличается от микробиоты здоровых доношенных детей [32,34–36]. Попытки связать определенные микробы с возникновением некротического энтероколита, состояния с подозрением на бактериальную этиологию, которое является важной причиной заболеваемости и смертности недоношенных детей, дали неоднозначные результаты [32,36].Очевидно, что еще многое предстоит узнать о происхождении и развитии микробиоты желудочно-кишечного тракта младенцев и ее влиянии на здоровье и болезни.

Мы сосредоточили наше исследование на описании ряда профилей, составляющих здоровую микробиоту желудочно-кишечного тракта младенцев, в надежде обнаружить темы, которые управляют ее развитием, а также предоставить подробный справочник и прочную основу для последующих исследований, посвященных изучению факторов, влияющих на Микробиота ЖКТ. В нашем исследовании участвовали 14 здоровых доношенных детей, рожденных от 13 здоровых матерей (включая одну группу разнояйцевых близнецов) (Таблица 1).Образцы стула собирали в соответствии с установленным графиком, начиная с первого стула после рождения: образцы собирали сначала ежедневно, а затем с уменьшающейся частотой в течение 1 года, с дополнительным отбором образцов вокруг ключевых событий (например, введение твердой пищи и введение антибиотиков), что дает в среднем 26 образцов стула на каждого ребенка (Таблица 2). Кроме того, у родителей, братьев и сестер были взяты образцы стула, а у матерей — вагинальные мазки и грудное молоко.Мы проанализировали микробиоту каждого из этих образцов с использованием недавно разработанной микроматрицы рДНК SSU, предназначенной для почти полного охвата известных видов рДНК SSU. Подмножество этих образцов было также проанализировано секвенированием библиотеки клонов рДНК SSU с целью калибровки и проверки результатов наших микрочипов.

Результаты

Сравнение профилей бактериальных популяций на основе микрочипов и последовательностей

Чтобы изучить состав нашего набора образцов и обеспечить основу для количественной калибровки результатов микрочипов, мы создали контрольный пул, объединив равные количества амплифицированной рДНК SSU из каждого ПЦР-амплифицируемого образца (за исключением образцов, собранных, когда младенцы были ≥1 года).Мы получили 3 458 высококачественных последовательностей клонов из библиотеки, созданной из этого пула, и таксономически присвоили каждой последовательности с помощью классификатора проекта базы данных рибосом [37]. Таксономическое распределение этих последовательностей суммировано в Таблице 3.

Чтобы оценить эффективность нашего нового дизайна микроматрицы относительно секвенирования рДНК SSU, мы секвенировали рДНК SSU, амплифицированные из каждого из 12 индивидуальных биологических образцов, полученных в этом исследовании, выбранных по их разнообразным профилям с помощью анализа микроматрицы 16S рДНК.Этот набор исследований включал ДНК, выделенную из восьми детских стула, двух материнских стула, одного вагинального мазка и одного образца грудного молока. Для каждого из этих образцов мы амплифицировали последовательности рДНК SSU с использованием тех же праймеров ПЦР, которые использовались в анализе микрочипов, затем клонировали и секвенировали несколько сотен (среднее значение = 342) амплифицированных продуктов для всего 4100 последовательностей.

Мы сосредоточили наше сравнение на уровнях 2, 3 и 4 иерархии прокариотического выравнивания множественных последовательностей (prokMSA), которые очень приблизительно соответствуют уровням типа, класса и порядка в классической таксономической иерархии.На этих более широких уровнях ожидается, что большинство последовательностей будут иметь гомологию по крайней мере с одним зондом в нашем текущем дизайне микрочипов, и последовательности рДНК, как правило, можно однозначно классифицировать. Оценки относительной численности на основе микрочипов были получены для 2149 видов и таксономических групп путем объединения данных от всех зондов, которые представляли любое подмножество рассматриваемого класса, как полностью описано в разделе «Материалы и методы». Оценки на основе последовательностей были получены путем таксономической классификации каждой последовательности путем присвоения кода операционной таксономической единицы (OTU) prokMSA наилучшего соответствия BLAST в базе данных prokMSA 2004 года из 86 453 последовательностей гена рибосомной РНК (рРНК) SSU [38] (наборы данных S1 и S2 ).Хотя относительную численность бактериального вида нельзя точно определить из его пропорционального представительства в пуле амплифицированных последовательностей рДНК, мы ожидаем, что такие оценки должны быть точными в пределах порядка величины и обычно в пределах нескольких раз [39–41], на основе предыдущих исследований, в которых сравнивали уровни численности, оцененные на основе секвенирования ампликонов рДНК SSU, с подсчетами, основанными на гибридизации in situ.

В целом результаты микроматрицы были очень похожи на результаты, полученные путем секвенирования, как качественно, так и количественно.На рисунке 1А показано сравнение профилей сообществ каждого из 12 образцов, полученных в результате нашего анализа микрочипов и путем секвенирования, для каждой таксономической группы на уровне 2 таксономического дерева prokMSA. Обратите внимание, что уровни (например, уровень 2) в таксономии prokMSA не имеют последовательного соответствия уровням (например, типу) в классической таксономической иерархии, и, таким образом, некоторые из традиционных имен, связанных с группами уровня 2 prokMSA, могут выглядеть несколько несочетаемый. Как анализ последовательностей, так и анализ микрочипов показали, что в образцах преобладает ограниченное число таксономических групп — 99% из 4100 последовательностей охватываются всего тремя из 22 подразделений prokMSA уровня 2: 2.15 (Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides), 2,28 (Proteobacteria) и 2,30 (грамположительные бактерии [включая Firmicutes и Actinobacteria]), а оставшийся 1% принадлежал к группам 2,10 (Prosthecobacter), 2,29 (Fusobacteria) , или 2,21 (цианобактерии и хлоропласты). Как показано на рис. 1B и 1C, профили населения, полученные с помощью микроматрицы и анализа секвенирования, также были количественно схожи — корреляция Пирсона оценок относительной численности на основе микрочипов и секвенирования для 12 образцов была равна 0.97 на таксономическом уровне 2 prokMSA (рис. 1В), 0,89 на уровне 3 (рис. 1С) и 0,80 на уровне 4 (неопубликованные данные).

Рис. 1. Сравнение профилей сообществ на основе микрочипов и секвенирования

Полученные с помощью микрочипов и результаты секвенирования оценки численности таксономических групп сравниваются для 12 биологических образцов.

(A) Сравниваются оценки численности для всех таксонов prokMSA уровня 2, измеренные на массиве. Каждый столбец представляет собой один биологический образец, а каждая строка соответствует одной таксономической группе, идентифицируемой (справа от каждой строки) своим числовым кодом prokMSA OTU вместе с примерно соответствующим условным названием группы.

(B) Сравнение оценок относительной численности на основе последовательностей и микрочипов для таксономических групп уровня 2 в 12 образцах (то же, что и в [A]). Ось x представляет относительную численность, оцененную по частоте клонов из данной таксономической группы, а ось y представляет относительную численность, оцененную с помощью профилирования микроматрицы.

(C) То же, что (B) для таксономических групп уровня 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g001

Абсолютное количественное определение бактерий

Мы оценили общую плотность бактерий в каждом образце с помощью количественного анализа ПЦР (КПЦР) в реальном времени, используя широкий набор бактериальных праймеров и зондов (см. «Материалы и методы»). Мы использовали общее количество копий гена рРНК (обычно около пяти на геном [42]) на грамм стула, как оценивалось с помощью этого анализа, чтобы приблизительно определить общую плотность бактерий. Как показано на рисунке 2, общее количество копий гена рРНК было относительно нестабильным в течение первой недели жизни, а затем сохранялось у большинства младенцев в диапазоне от 10 ⁹ до 10 ¹⁰ / г стула (сырой вес).Хотя явного влияния метода родоразрешения на время колонизации не наблюдалось, следует отметить, что младенцы 13 и 14 лет (близнецы с дизиготом), которые были единственными младенцами, родившимися с помощью планового кесарева сечения и, следовательно, без разрыва околоплодных вод. мембрана и воздействие микробиоты родовых путей матери во время схваток или родоразрешения имели низкое количество бактерий (<10 ⁸ копий гена рРНК / г) до седьмого дня жизни.

Рис. 2. Изменение общей плотности фекальных бактерий в течение первого года жизни.

Для каждого образца ребенка численность бактерий оценивалась с помощью TaqMan ПЦР в реальном времени с универсальными бактериальными праймерами. Расчетные копии гена рРНК на грамм фекалий ( y -ось) нанесены на график как функция дней жизни ( x -ось). Обе оси имеют логарифмическую шкалу. Измерения обилия усечены по нижнему краю до значения, соответствующего 95-му процентилю экстракционных (отрицательных) контролей (количество копий, скорректированное на среднюю массу стула). Эпизоды антибактериального или противогрибкового (нистатин) лечения обозначены на временной оси серыми или розовыми полосами соответственно (дополнительную информацию см. В Таблице 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g002

Обзор профилей популяции бактерий на основе микрочипов

Мы проанализировали бактериальный состав 430 образцов — 363 образца детского стула, 43 образца стула взрослых, 2 образца стула братьев и сестер, 12 образцов грудного молока и 10 материнских вагинальных мазков — путем гибридизации с микрочипом ДНК, разработанным в этом исследовании. Объединив информацию по нескольким зондам (см. Материалы и методы), мы получили оценки относительной численности для 2149 вложенных таксономических групп и видов в каждой из этих выборок (все зонды перечислены в наборе данных S3; все таксоны перечислены в наборе данных S4).Как показано на рисунке 3, разнообразие на уровне филумов в образцах стула, проанализированных в этом исследовании, было чрезвычайно ограниченным. В подавляющем большинстве образцов преобладали всего три из 22 бактериальных групп уровня 2, представленных нашим микрочипом: 2,15 (Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides), 2,28 (Proteobacteria) и 2,30 (грамположительные бактерии [Firmicutes и Actinobacteria] ). Вторым важным открытием стала замечательная степень индивидуальных различий в процессе колонизации. Хотя таксоны, населяющие желудочно-кишечный тракт младенца, были ограничены на самых широких уровнях, каждый ребенок отличался сочетанием видов микробов, которые он приобрел и поддерживал, а также точным временным паттерном, в котором эти виды появлялись и исчезали. Bacteroides, , например, доминировали в ранней микробиоте некоторых младенцев, но практически отсутствовали на этой стадии у других младенцев. Третьей поразительной особенностью этого набора данных была относительная стабильность микробных популяций во времени — даже на ранних этапах заселения желудочно-кишечного тракта младенца большинство таксономических групп сохранялось в течение интервалов от недель до месяцев.

Рисунок 3. Обзор профилей микробных сообществ всех образцов

Каждый столбец ( n = 430) представляет один биологический образец, а каждая строка ( n = 2149) представляет одну таксономическую группу или вид.Выборки организованы во временном порядке, начиная с рождения слева и любых выборок, полученных от матери или других семей, справа от каждого временного курса. Клинья над столбцами пронумерованы в соответствии с идентификатором ребенка. Строки (таксоны) сортируются по их числовым кодам, так что подгруппы данной группы лежат непосредственно под более общей группой (например, 2.15, затем 2.15.1, затем 2.15.1.1). Символы «>» и «>>» добавляются к названиям помеченных таксономических групп, которые являются подгруппами на уровне 3 или уровне 4, соответственно, помеченной таксономической группы уровня 2.Увеличение темноты в градациях серого соответствует более высокому расчетному относительному содержанию.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g003

Основными измерениями различий между профилями колонизации различных таксономических групп были время колонизации и временная стабильность. В соответствии с предыдущими исследованиями [28,35,43,44], первыми колонизаторами часто были организмы, которые, как предполагалось, были аэробами (например, Staphylococcus, Streptococcus, и Enterobacteria), тогда как более поздние колонизаторы, как правило, были строгими анаэробами (Eubacteria и Clostridia) . Бактероиды сильно различались от ребенка к ребенку по времени своего первого появления, но в некоторой степени постоянно присутствовали почти у всех младенцев к 1 году. Несколько других таксонов, в том числе Prevotella, Acinetobacter, Desulfovibrio, Veillonella, и Clostridium perfringens, , имели тенденцию появляться временно, иногда появляясь и исчезая повторно в течение первого года жизни ребенка.

Сходства и различия между профилями населения

Мы исследовали сходства и различия в составе всех наших выборок путем иерархической кластеризации 430 образцов на основе их сходства в отношении их профилей численности для набора из 53 таксономических групп prokMSA уровня 4, которые имели как минимум две выборки с относительной оценка численности превышает 1%.Схема кластеризации, отраженная в дендрограмме в верхней части рисунка 4, выделяет несколько важных особенностей программы колонизации и показывает, что микробиота стула детей в возрасте 1 года и старше заметно отличается от таковой в более раннем возрасте и намного больше. как у взрослых. До 6 мес. Образцы стула имели тенденцию группироваться по каждому ребенку, что указывает на то, что различия от ребенка к ребенку намного больше, чем изменения в течение недель или месяцев в составе микробиоты любого отдельного ребенка.Было два заметных исключения из этой кластеризации, ориентированной на ребенка. Во-первых, образцы из первых нескольких дней жизни часто сгруппированы отдельно от остальных образцов данного ребенка, иногда сгруппировавшись с другими очень ранними образцами, а иногда с образцами из других мест (например, ребенок 8-го дня 1 с образцами из влагалища). Во-вторых, образцы от младенцев 13 и 14, которые являются разнояйцевыми близнецами, как правило, смешивались. На рисунке 4B показаны примеры нескольких описанных выше шаблонов кластеризации.

Рисунок 4.Кластеризация выборок на основе профилей популяций наиболее распространенных и многочисленных таксонов

(A) Каждый столбец ( n = 430) представляет один биологический образец, а каждая строка ( n = 52) представляет одну таксономическую группу или вид 4 уровня. для двух или более образцов оценки относительной численности превышали 1%. Представлены все образцы, включая образцы стула от младенцев, родителей и братьев и сестер, а также образцы молока и влагалища. Образцы были сгруппированы по центрированной корреляции Пирсона, так что столбцы, представляющие наиболее похожие образцы, сгруппированы вместе, тогда как таксономические группы (строки) сортируются численно, а не кластеризоваться.Увеличение темноты в градациях серого соответствует более высокому расчетному относительному содержанию. Значения log ₂ относительной численности.

(B) Отобранные кластеры, иллюстрирующие, что (1) профили из образцов стула раннего ребенка группируются по младенцу, (2) образцы стула очень раннего ребенка объединяются с образцами матери и (3) образцы из пары разнояйцевых близнецов группируются вместе и смешиваются.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g004

Большинство образцов грудного молока и материнского влагалища идеально сгруппированы по анатомическим участкам происхождения.Как и ожидалось, во всех вагинальных образцах, кроме одного, преобладали лактобациллы, включая Staphylococci , Bacteroides, Clostridia и Veillonella среди групп, которые в разной степени присутствовали как составляющие меньшинства. Влагалищный образец от одной из матерей (матери ребенка 11) имел отчетливо другой профиль популяции, в котором преобладали представители группы гамма-протеобактерий. Популяции микробов, обнаруженные в образцах молока, были разнообразными, часто включая смеси кишечных бактерий и видов Bacteroides, Pseudomonas, Haemophilus, Veillonella, и Streptococcus .

Для более систематического сравнения младенцев мы определили выборку ближайших соседей для каждой выборки, измеренную с помощью корреляции Пирсона оценок относительной численности уровня 4. Используя эту метрику, выборка ближайшего соседа любой данной выборки ребенка обычно была другой выборкой от того же ребенка — средний процент образцов от данного ребенка, для которых наиболее похожая выборка была от того же ребенка, составляла 82%. Рисунок 5 суммирует этот анализ и иллюстрирует интересный вывод о том, что по этому показателю наиболее похожей парой младенцев были младенцы 13 и 14 лет — разнояйцевые близнецы, воспитанные в одной и той же среде — 8 из 23 (35%) ближайших младенцев 13 лет. — образцы соседей были взяты от ребенка 14 (следующей наиболее похожей парой были дети 11 и 14 лет — 17%).

Рис. 5. Сходство микробиоты у младенцев

Для каждой пары образцов мы рассчитали образцы ближайших соседей в соответствии с корреляцией Пирсона профилей относительной численности уровня 4. Затем для каждого ребенка мы вычислили, какой процент выборок ближайшего соседа был получен от каждого ребенка. Оттенок серого указывает процент образцов из детского Y (столбец), которые были ближайшими соседями образцов из детского X (строка), так что суммы строк составляют 100%.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.0050177.g005

Временные тенденции

Сходство профилей микробных сообществ в образцах стула младенцев от 1 года и старше друг с другом и с профилями стула взрослых предполагает, что со временем сообщества желудочно-кишечного тракта младенцев сошлись в сторону обобщенной «взрослой» микробиоты. Мы исследовали этот феномен, вычислив для каждого возрастного интервала среднюю попарную корреляцию Пирсона в профилях населения всех выборок младенцев, собранных в этом возрасте.Как показано на рис. 6А, этот анализ показал, что с течением времени микробиота младенцев постоянно приближалась к общему профилю. Мы также рассчитали для каждой временной точки среднюю корреляцию выборок младенцев в этот момент времени с обобщенным профилем взрослого (центроид 18 выборок взрослых — девять отцов и девять матерей из этого исследования). Этот анализ, показанный на рисунке 6B, подтвердил, что профиль, к которому сходится микробиота младенцев, аналогичен профилю взрослых, и выявил очевидную тенденцию к перегруппировке популяции, которая происходит примерно через 5 дней после рождения.Примечательно, что микробиота желудочно-кишечного тракта младенцев не была значительно больше похожа на микробиоту их родителей, чем на микробиоту других взрослых, если судить по корреляциям Пирсона их таксономических профилей уровня 4 (средняя корреляция ребенок-родитель 0,55 для внутри семьи по сравнению с 0,62. между семьями для девяти «триад» одновременно полученных образцов от ребенка, матери и отца, полученных в возрасте 1–1,5 года).

Рис. 6. Временные паттерны среднего попарного сходства профилей микробиоты детского стула

(A) Сходство между младенцами во времени.Для каждой временной точки, для которой было профилировано не менее шести младенцев, мы рассчитали среднюю попарную корреляцию Пирсона между таксономическими профилями уровня 4 всех младенцев в этот момент времени. Также показана средняя парная корреляция Пирсона между этими профилями у 18 взрослых участников этого исследования (девять мужчин и девять женщин) (пустой кружок обозначен стрелкой).

(B) Переход к взрослой флоре с течением времени. Для каждой временной точки, для которой был составлен профиль по крайней мере четырех младенцев, мы рассчитали среднюю корреляцию Пирсона между таксономическими профилями уровня 4 всех младенцев в этот момент времени и «общим взрослым» профилем.Общий профиль взрослого — это центроид 18 взрослых (девять мужчин и девять женщин) (родители в этом исследовании).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g006

Чтобы визуализировать временные закономерности в определенных филогенетических группах, населяющих кишечник младенца, мы составили график относительной численности девяти таксономических групп уровня 4, которые имели средняя относительная численность 1% или более с течением времени у каждого младенца (рис. 7). Этот анализ позволил нам выявить общие темы и интересные различия между профилями колонизации этих младенцев.Во-первых, мы заметили, что «неравномерные» популяции (популяции, в которых преобладает одна таксономическая группа) были обычны в первые несколько недель, но редки в более поздние сроки. Другой примечательной особенностью временной программы многих младенцев было возникновение одного или нескольких резких сдвигов в структуре популяции — такие сдвиги часто стабилизировались в пределах одного интервала выборки. Нам не удалось идентифицировать какой-либо конкретный возраст или сигнальное событие, постоянно связанное с такими переходами, хотя переход к «взрослому» профилю часто сопровождал введение твердой пищи.

Рисунок 7. Временные профили наиболее обильных таксономических групп уровня 3

Таксономические группы уровня 3 были выбраны для отображения, если их средняя (нормализованная) относительная численность по всем образцам детенышей превышала 1%. Ось x показывает дни с момента рождения и отображается в логарифмической шкале, а ось x показывает оценочную (нормализованную) относительную численность. Для некоторых младенцев значения для первых нескольких дней не отображаются, поскольку общее количество бактерий в образцах стула, собранных в эти дни, было недостаточным для анализа на основе микрочипов.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.g007

Несколько младенцев получали антибиотики либо в неонатальный период (дни 0–28), либо в более поздние месяцы (см. Таблицу 1 и Рисунок 2). Больше подробностей). В некоторых случаях лечение было связано с резким изменением плотности или состава микробиоты желудочно-кишечного тракта. Например, ребенок 8 получил два курса амоксициллина: один в 4 мес. И один в 6 мес. В обоих случаях как общая плотность бактерий (Рисунок 2), так и состав сообщества резко изменились (Рисунки 3 и 6).Действительно, у этого ребенка плотность бактерий в образцах кала снизилась настолько во время курсов антибиотиков, что мы не смогли амплифицировать достаточное количество рДНК SSU для анализа микрочипов, поэтому мы могли сравнивать популяции только до и после курса антибиотиков. Однако мы не выявили каких-либо устойчивых последствий лечения антибиотиками.

Эксперименты по валидации микрочипов

Результаты как анализа последовательности эталонного пула, так и анализа данных микроматрицы показали, что бифидобактерии были лишь второстепенными компонентами популяции — результат расходится с общепринятым мнением [20,21,26].Праймеры, которые мы использовали для широкой ПЦР-амплификации контрольного пула (источник последовательностей), и образцы для анализа микрочипов были потенциально неоптимальными для амплификации Bifidobacteria [21,26] из-за трех несовпадений в последовательности рДНК Bifidobacterium longum и прямой праймер 8F, использованный в этом исследовании. Обзор 5′-последовательностей полноразмерных генов рДНК SSU показал, что бифидобактерии резко отличаются от обычно консервативной последовательности праймера 8F. Поэтому мы провели два независимых анализа, чтобы определить, нужно ли и каким образом корректировать количественные оценки бифидобактерий по результатам гибридизации микрочипов.Во-первых, мы количественно оценили относительную эффективность, с которой пара праймеров 8F / 1391R амплифицировала рДНК SSU из двух видов Bifidobacterium — Bifidobacterium longum и Bifidobacterium infantis — по сравнению с набором из трех различных распространенных фекальных бактерий — Escherichia coli, Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis — все они имеют последовательности рДНК SSU с одним или несколькими несовпадениями с последовательностями праймеров 8F / 1391R ПЦР. Используя ряд стехиометрических смесей хромосомной ДНК, выделенных из этих видов, мы обнаружили, что после 20 циклов (количество циклов, использованных для наших анализов микроматриц и для амплификации контрольного пула перед секвенированием), эффективность амплификации двух видов бифидобактерий ДНК была в 8 раз ниже, чем у трех других видов, все из которых амплифицировались с почти одинаковой эффективностью (неопубликованные данные).Этот результат предполагает, что как результаты секвенирования контрольного пула, так и количественный анализ на основе микрочипов занижали численность группы бифидобактерий в восемь раз. Во-вторых, мы использовали анализ кПЦР в реальном времени с парой праймеров и зондом, оптимизированными для обнаружения бифидобактерий, чтобы получить независимую оценку численности бифидобактерий в каждом образце. Результаты подтвердили вывод микроматричного анализа о том, что бифидобактерии почти всегда были лишь второстепенными составляющими фекальной микробиоты как младенцев, так и взрослых в нашей исследуемой популяции (набор данных S5 и рисунок S1).

Большинство видов бактерий, идентифицированных в нашем наборе образцов, ранее входили в состав микробиоты желудочно-кишечного тракта человека. Однако был ряд случаев, в которых результаты микроматрицы указывали на присутствие вида или группы бактерий, которые были неожиданными и не представлены в нашем пуле секвенированных эталонов. Мы исследовали несколько из этих случаев с помощью независимых тестов. Для 12 подозрительных видов / таксонов мы использовали специфичные для родственных групп праймеры в ПЦР-анализе, примененном к большинству или всем образцам, в которых подозреваемые виды / таксоны, по-видимому, присутствовали на основании результатов микроматрицы, а также небольшой набор образцов, в которых подозрительные виды не были обнаружены микрочипом.В одном случае, в случае Sutterella wadsworthia, секвенирование видоспецифичного продукта ПЦР подтвердило его присутствие. В семи из 12 случаев ни один из массивов положительных (или отрицательных) образцов не дал амплифицированного продукта при анализе ПЦР. В четырех оставшихся случаях анализ якобы видоспецифической ПЦР дал амплифицированный продукт ожидаемого размера, но клоны, секвенированные из этого продукта, не соответствовали ожидаемым видам. Мы дополнительно исследовали эти четыре случая путем секвенирования библиотеки клонов, полученной путем амплификации с теми же праймерами широкого диапазона, которые использовались при подготовке к анализу микрочипов.Хотя секвенирование не подтвердило присутствие какого-либо из четырех сомнительных видов / таксонов, оно предоставило убедительные доказательства основного источника ложноположительных сигналов гибридизации. В частности, в трех из четырех случаев мы идентифицировали относительно многочисленные виды, чья последовательность рДНК была достаточно похожа на последовательность зонда, что, вероятно, объясняло наблюдаемый сигнал. В одном случае (Legionella pneumophila), , присутствие которого, согласно прогнозам, составляло примерно 1%, мы не смогли идентифицировать какие-либо виды-кандидаты, которые могли бы объяснить сигнал гибридизации (т. Е.е., ни один с лучшими совпадениями BLAST ≥30 баллов) среди нашего набора из 192 последовательностей. Поскольку наша способность обнаруживать виды, присутствующие с частичной численностью 1%, составляла всего 85%, остается возможным, что этот вид или другой вид со сходной последовательностью рДНК SSU мог присутствовать в небольшом количестве в подозрительных образцах.

Обнаружение и количественная оценка грибов и архей

Наши методы экстракции ДНК и амплификации рДНК были оптимизированы для бактерий и неоптимальны для эукариот и архей, поэтому мы отдельно проверили наличие и численность грибов или архей с помощью анализов кПЦР с широкой специфичностью для соответствующих таксономических групп.На основании нашего анализа количественной ПЦР, грибки периодически обнаруживались в образцах стула при относительно низкой численности (10 ⁴ –10 ⁶ генов рРНК / г сырой массы фекалий), сохраняющихся в течение различной продолжительности у отдельных детей в течение первого года жизни. . У одного из детей, участвовавших в этом исследовании (ребенок 10 лет), была отмечена сыпь от подгузников, а также молочница во рту, которые обычно вызываются грибком (Candida), и лечились противогрибковыми препаратами (нистатином). ). Анализ qPCR обнаружил особенно высокие уровни грибковой рДНК в образцах стула этого ребенка, особенно в тот период, когда были описаны эти результаты.У матери этого ребенка также были заметно высокие уровни грибковых последовательностей рДНК SSU в пренатальном образце вагинального мазка, но не в образце стула «нулевого дня».

Распространенность архей была значительно ниже и более вариабельна, чем распространенность грибов или бактерий; Анализ qPCR обнаружил гены архейной рРНК (в диапазоне 10 ³ –10 ⁶ генов рРНК / г) только у семи младенцев в течение первого года жизни, а у четырех из этих младенцев они были обнаружены только у одного образец.У этих младенцев археи появлялись временно и почти исключительно в первые несколько недель жизни; они были обнаружены только у одного младенца после пятой недели жизни. Ограниченный анализ последовательностей архей, амплифицированных из трех образцов стула матери, которые дали положительный результат на археи (матери 4, 9 и 12), выявил преобладание Methanobrevibacter smithii (идентифицировано 7/8 архейных клонов, включая по крайней мере по одному клону от каждой матери), с одним дополнительным (некультурным) архейным филотипом.Результаты анализа количественной ПЦР грибов и архей включены в набор данных S5 и показаны графически вместе с результатами количественной ПЦР бактерий на Фигуре S2.

Обсуждение

Микробная колонизация желудочно-кишечного тракта младенца — примечательный эпизод в жизненном цикле человека. Каждый раз, когда рождается человеческий ребенок, из стерильной среды развивается богатая и динамичная экосистема. В считанные дни микробные иммигранты создают процветающее сообщество, население которого вскоре превосходит численность собственных клеток ребенка.Эволюционно древний симбиоз между желудочно-кишечным трактом человека и его резидентной микробиотой, несомненно, включает в себя разнообразные взаимные взаимодействия между микробиотой и хозяином, что имеет важные последствия для здоровья и физиологии человека. Эти взаимодействия могут иметь полезные пищевые, иммунологические эффекты и эффекты развития или патогенные эффекты для хозяина [2,5,7,18,45].

Это исследование началось с разработки микрочипа ДНК с почти полным охватом бактериальных таксонов, представленных в доступной базе данных последовательностей генов SSU рРНК.Наш дизайн микроматрицы и экспериментальные методы были основаны на уроках, извлеченных при валидации менее полной микроматрицы SSU рДНК [46]. Эти предыдущие эксперименты позволили нам оптимизировать наши методы для компьютерного прогнозирования поведения гибридизации SSU рДНК и разработать экспериментальный протокол, который максимизировал специфичность гибридизации. Превосходное согласование измерений отдельных таксонов, определенных с использованием нового дизайна микрочипов, по сравнению с результатами секвенирования из соответствующих библиотек клонов рДНК SSU (рисунок 1) предполагает, что эти принципы дизайна верны для этой платформы для множества таксонов и дают нам уверенность полнота и точность результатов, полученных с помощью нашего нового набора микрочипов.Однако важно отметить, что наши методы проектирования и анализа массивов несовершенны и все еще развиваются. Некоторые из неожиданных видов, которые, по прогнозам микроматрицы, должны присутствовать в одном или нескольких образцах, не могли быть подтверждены секвенированием. В большинстве этих случаев анализ последовательности исследуемых образцов показал, что перекрестная гибридизация на низком уровне высокоразвитых видов была ответственна за ложноположительный прогноз, результат, который будет приниматься во внимание в будущих раундах массива. дизайн и анализ.

Мы использовали этот микрочип в подробном, систематическом и количественном исследовании бактериальной колонизации желудочно-кишечного тракта новорожденного человека. Мы использовали только что собранные образцы стула в качестве заменителей образцов, взятых из просвета и слизистой оболочки толстой кишки. Хотя, несомненно, существуют различия в популяционных профилях образцов стула и соответствующих слизистых оболочек, в предыдущем исследовании мы обнаружили, что профили, тем не менее, удивительно согласованы — достаточно, чтобы отдельные образцы стула можно было легко сопоставить с образцами биопсии толстой кишки от одного и того же человека на основе на сходство их бактериальных профилей [15,46].Таким образом, мы полагаем, что результаты нашего временного анализа бактериальных популяций в образцах детского стула предоставляют полезное окно для анализа резидентной микробиоты толстой кишки.

Принимая во внимание важность симбиоза между человеческим хозяином и кишечными комменсалами как для человека-хозяина, так и для микробного колониста, было бы легко представить, что программа микробной колонизации желудочно-кишечного тракта новорожденных развивалась под сильным избирательным давлением, воздействуя на как кишечная ниша, так и ее микробные колонисты должны быть сильно детерминированными и стереотипными.Мы могли ожидать, что весьма ограниченная группа совместно эволюционирующих комменсалов будет исключительно хорошо адаптирована к этой среде и будет последовательно доминировать в процессе колонизации стереотипным образом. Действительно, бактерии, которые мы обнаружили в кале младенцев и взрослых, предположительно отражающие микробиоту толстой кишки, были в значительной степени ограничены лишь небольшой подгруппой бактериального мира — Proteobacteria, Bacteroides, Firmicutes, Actinobacteria и Verrucomicrobia. Тем не менее, к удивлению, мы обнаружили, что в первые дни или месяцы жизни микробиота кишечника младенца и временная структура, в которой она развивается, заметно варьируются от человека к человеку.Казалось бы, хаотичное развитие ранних событий колонизации и сходство бактериального состава некоторых ранних младенческих образцов с грудным молоком или вагинальными мазками позволяет предположить, что бактериальная популяция, которая развивается на начальных стадиях, в значительной степени определяется конкретными бактериями. которому случайно подвергается ребенок. Примечательно, что эти материнские «сигнатуры» не сохранялись бесконечно, о чем свидетельствует наша неспособность найти значительно более высокую корреляцию общих таксономических профилей пар ребенок / родитель из одного и того же домохозяйства по сравнению с разными домохозяйствами.

Важным исключением из рассказа об индивидуальности и уникальности ранних профилей было поразительное сходство временных профилей разнояйцевых близнецов (младенцев 13 и 14) (Рисунки 4 и 5). Эти близнецы имели как общую среду обитания, так и примерно 50% генетической идентичности, что делает невозможным определение из этого исследования, в какой степени каждая из этих общих черт ответственна за их сходные модели колонизации. Однако данные этого и других исследований свидетельствуют о том, что общая среда является основным фактором.Одним из аргументов в пользу этой точки зрения является отсутствие сопоставимого сходства в микробных сообществах других пар, которые также имеют 50% генетическую идентичность, включая мать: ребенок, отец: ребенок и родной брат: ребенок (неопубликованные данные), хотя это несходство может отчасти из-за разных стадий их развития. Еще один аргумент в пользу сильного влияния окружающей среды — это случайное временное появление определенных организмов у обоих близнецов — трудно представить, что появление определенного микроба в определенный день может быть генетически запрограммировано.Наш последний аргумент основан на доказательствах из предыдущего исследования, что микробиота генетически эквивалентных семей от скрещивания инбредных мышей была более похожей среди членов одного и того же «домохозяйства» (мать и потомство, живущие в одной клетке), чем между домохозяйствами [1].

Определение «здоровой» кишечной микробиоты охватывает удивительное разнообразие профилей сообщества в первые 6 месяцев жизни. Хотя в первые месяцы эти микробные сообщества были разнообразными и своеобразными, они постепенно становились все более похожими друг на друга (рис. 6А), приближаясь к общему профилю, подобному взрослому (рис. 6В), характеризующемуся преобладанием Bacteroides и Firmicutes, часто встречающихся Веррукомикробия и очень низкая численность протеобактерий и аэробных грамотрицательных бактерий в целом.Мы предполагаем, что самые ранние события колонизации в значительной степени определяются условно-патогенной колонизацией бактериями, которым ребенок подвергается в окружающей среде. Общие воздействия окружающей среды, вероятно, включают микробиоту влагалища, фекалий или кожи матери, о чем свидетельствует наблюдаемое сходство микробиоты раннего стула у некоторых младенцев с этими образцами, что согласуется с предыдущими доказательствами вертикальной передачи микробов [33,47 , 48]. Таким образом, разнообразие и вариативность отражают соответствующую индивидуальность этих случайных воздействий.Однако со временем преимущество пригодности таксонов, которые обычно доминируют в микробиоте толстой кишки взрослых особей, по-видимому, преодолевает первоначальное преимущество оппортунистов, колонизирующих рано, которые менее приспособлены к кишечной среде. Кроме того, прогрессирующие изменения в кишечной среде из-за внутренних изменений слизистой оболочки кишечника, перехода на «взрослую» диету и влияния самой микробиоты [44,49–51] могут требовать все более строгого отбора для наиболее адаптированные бактерии.Таким образом, несмотря на неожиданно хаотичный период первых месяцев жизни, становление экосистемы кишечника у младенцев, в конце концов, следует консервативной традиционной программе.

Трансформация кишечной микробиоты по образцу взрослого неявно включала замену видов, обнаруживаемых у младенцев, но редко у взрослых, видами, характерными для толстой кишки взрослых. Одной из потенциальных движущих сил таких демографических изменений может быть то, что взрослые члены сообщества в конечном итоге доминируют в силу их большей способности устойчиво и необратимо утвердиться после колонизации хозяина.Мы искали доказательства этой дифференциальной «липкости», сравнивая автокорреляцию во времени численности каждого «вида» (см. Материалы и методы). Мы не нашли четких доказательств того, что виды, характерные для взрослой микробиоты, смогли установить более стабильную по своей природе колонизацию, чем виды, характерные для детской микробиоты.

Мы и другие обнаружили, что индивидуально-специфические характеристики бактериальной микробиоты взрослых стабильны в том смысле, что они остаются более похожими у одного человека с течением времени, чем между отдельными людьми, в течение периода в год или более, и одного из поразительными результатами этого исследования было выявление относительно стабильных, индивидуальных паттернов бактериальной колонизации даже в первые недели и месяцы жизни.Эти наблюдения открыли интересную возможность того, что события оппортунистической колонизации в раннем младенчестве могут играть значительную роль в определении различных характеристик микробиоты одного и того же человека во взрослой жизни. Мы искали доказательства этого, сравнивая внутрииндивидуальные и межиндивидуальные корреляции бактериальных профилей через 1 или 2 мес. И 1 год, и не обнаружили существенной разницы (неопубликованные данные). Таким образом, хотя эти результаты, безусловно, не исключают возможности того, что события ранней колонизации играют важную роль в определении взрослой микробиоты, не похоже, что между ними существует сильная прямая корреляция.

Наши результаты и выводы значительно отличаются от многих предыдущих отчетов по нескольким аспектам. Одним из заметных расхождений между нашими исследованиями и многими другими была относительно низкая частота и численность бифидобактерий в фекальной микробиоте в любом возрасте от рождения до взрослого возраста. Бифидобактериям уделялось непропорционально большое внимание, отчасти из-за их предполагаемых положительных эффектов, и во многих исследованиях сообщалось (и повторялись обзоры), что в микробиоте грудных детей преобладают бифидобактерии [17–19].Таким образом, мы были удивлены и поначалу скептически относились к очевидной малочисленности бифидобактерий почти во всех наших образцах и предприняли шаги для проверки точности наших результатов. Специфическая кПЦР для бифидобактерий подтвердила вывод результатов наших микроматриц о том, что бифидобактерии редко были основными составляющими микробиоты желудочно-кишечного тракта, по крайней мере, в этой исследуемой популяции, и что у большинства младенцев они появлялись только через несколько месяцев после рождения, а затем сохранялись как меньшинство населения.Хотя можно предположить, что существуют географические или демографические различия в распространенности бифидобактерий, мы подозреваем, что акцент на бифидобактерии в исследованиях и обзорах микробиоты желудочно-кишечного тракта младенцев может быть несоразмерным их распространенности, численности и значимости для здоровья.

Представленные здесь результаты указывают на многочисленные направления будущих исследований. Интересной особенностью динамики бактериальной популяции было появление резких сдвигов, перемежающих интервалы относительной стабильности.За исключением одного случая (лечение антибиотиками ребенка 8 лет), мы не смогли легко определить точного кандидата в причину наблюдаемых нами сдвигов. Некоторые возможности включают вспышки бактериофагов, которые могут выборочно уничтожить доминирующую таксономическую группу [52]; случайное, условно-патогенное вторжение в метаболическую или анатомическую нишу более приспособленным видом; и тонкие изменения кишечной среды, вызванные развитием или диетой, нарушающие физический баланс популяции. Другими важными направлениями будущих исследований будут сравнение состава и эволюции микробных сообществ, встречающихся у этих здоровых детей, с сообществами недоношенных или других нездоровых детей, а также изучение влияния антибиотиков, диеты и способов родоразрешения на их развитие и эволюцию. сообщества.Несмотря на то, что здоровые дети в этом исследовании предполагали широкий диапазон профилей микробного сообщества, они были схожи в нескольких отношениях, в первую очередь в основных способствующих типах, в приобретении определенных ключевых типов с течением времени и в относительной стабильности их профилей. со временем. Возможно, что при других состояниях здоровья или болезни мы найдем либо виды или группы, которые являются новыми для этой среды, либо необычные комбинации этого недавно определенного набора «обычных» видов.

Важно отметить, что хотя мы показали, что микробиота кишечника становится все более стереотипной в течение первого года, четко установлено, что устойчивые межиндивидуальные различия сохраняются даже у взрослых [15,16].Когда и как развиваются эти стабильные «внутренние» характеристики микробиоты каждого человека? Как долго они сохраняются? Как различная стабильность колонизации разными бактериями связана с их микроанатомическими (например, крипта против ворсинок против слизистого слоя) или метаболическими нишами? Выявление экологических и генетических факторов, которые определяют отличительные характеристики микробиоты каждого человека, а также определение того, влияют ли эти индивидуальные особенности на физиологию и здоровье хозяина и каким образом, будет важной целью будущих исследований, в которых микроматрица, описанная в этом исследовании, будет быть полезным инструментом.

Материалы и методы

Разработка и производство микрочипов.

Микроматрица содержала 10 500 ДНК-зондов (10265 уникальных последовательностей). Зонды включали 1379 контрольных зондов (1144 уникальных последовательностей) и 9121 уникальных таксономически специфичных зонда (5938 зондов на групповом уровне и 3183 зондов на уровне видов), состоящих из 40-нуклеотидных (нуклеотидных) последовательностей, полученных из генов SSU рРНК, и выбранных для их специфичность к соответствующему виду или таксономической группе. Основные принципы проектирования подробно описаны в предыдущем отчете [46].Дизайн был основан на базе данных последовательностей рДНК prokMSA SSU 2004 года и филогенетическом дереве [38], содержащем 86 453 прокариотических последовательностей рДНК SSU (5 672 архей и 80 781 бактериальных), организованных в 672 архейных и 15 765 бактериальных ОТЕ. OTU были определены в prokMSA как группы последовательностей с оценками идентичности (как определено в [38]) выше 95% или 98% (в определенных родах, имеющих медицинское значение). Мы дистиллировали эту базу данных, выбрав одну высококачественную последовательность, репрезентативную для каждой OTU, и урезали последовательности до областей, амплифицированных универсальными бактериями (Bact-8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘[53] + 1391R: 5’- GACGGGCGGTGTGTRCA-3 ‘[54]) или архейный (Arch444 [55] / 1391R) праймеры.OTU в нашей сокращенной базе данных prokMSA были организованы в 945 (53 архейных + 892 бактериальных) таксономических групп (узлов), содержащих несколько OTU, и 92 отдельных «узла» OTU.

Номенклатура базы данных была такова, что каждая OTU была обозначена числовым кодом, который указывал на ее таксономию prokMSA, например, вид «1.2.3.4.5.6.007» принадлежит к суперварке 1, тип 1.2, класс 1.2.3, порядок 1.2 .3.4, семейство 1.2.3.4.5, род 1.2.3.4.5.6. В этой рукописи таксономические уровни упоминаются в соответствии с их глубиной в коде OTU, т.е.g., вид «1.2.3.4.5.6» принадлежит к группе с более широким охватом «1» на уровне 1 и к группе с меньшим охватом «1.2.3.4: на уровне 4».

Мы сгенерировали большой набор зондов-кандидатов, используя BLAST [56], чтобы предсказать возможность гибридизации перекрывающихся последовательностей из 40 нуклеотидов из каждой OTU в нашей базе данных дистиллированных последовательностей с каждой из других OTU в базе данных (путем разбиения каждой последовательности с окном на два). Последовательность считалась зондом-кандидатом для конкретной таксономической группы, если прогнозировалось, что она гибридизуется по крайней мере с 10% членов этой группы, а не с какими-либо членами, не входящими в группу, с использованием эмпирически определенного порога 28 из 40 совпадений BLAST — несовпадения (общее количество нуклеотидов за вычетом несовпадений соответствует лучшему совпадению BLAST для данной последовательности рДНК) в качестве предельного значения для потенциальной гибридизации [46].Из полученного набора зондов-кандидатов мы выбрали для каждого узла / таксономической группы два зонда, которые, по прогнозам, гибридизуются с наибольшей частью этой группы. Мы также выбрали зонды из нашего набора кандидатов таким образом, чтобы каждая OTU в нашей дистиллированной базе данных была представлена ​​зондами на максимально возможном количестве таксономических уровней. Из-за нехватки места в массиве мы не смогли напечатать видоспецифические зонды для каждой OTU в нашей базе данных. Вместо этого мы дополнили набор зондов на уровне группы, разработанных, как описано выше, тремя дополнительными наборами зондов.Во-первых, мы составили список видов бактерий, которые были либо релевантными с медицинской точки зрения, либо известными комменсалами человека. Мы определили коды prokMSA для каждого из этих видов и протестировали выбранную последовательность из этой OTU для видоспецифичных 40-нуклеиновых последовательностей, как определено баллом совпадения-несоответствия BLAST не более 27 для любой другой последовательности. Мы также оценили видоспецифичные зонды из нашей предыдущей конструкции массива [46] в контексте базы данных prokMSA и включили 467 таких видоспецифичных зондов, представляющих 286 видов.Последней категорией таксономических зондов были зонды «новые OTU» — 316 зондов, разработанные для представления недавно открытых «видов» рДНК SSU, которые были идентифицированы в исследованиях толстой кишки [15] или желудка [57] взрослого человека (новые OTU были определены ограничение идентичности 99%, как описано в исходных исследованиях). Наконец, наш дизайн микрочипа включал 1153 контрольных зонда — положительных и отрицательных — предназначенных для нормализации и систематического изучения гибридизационного поведения. Отрицательные контроли включали как последовательности, не относящиеся к рДНК, так и последовательности рДНК обратного комплемента, тогда как положительные контроли включали последовательности праймеров и несколько наборов перекрывающихся зондов, охватывающих полные гены SSU рРНК бактерий, архей и эукариот.Прикрепленные к поверхности олигонуклеотидные зонды были синтезированы in situ, как описано ранее [58], с 10-нуклеотидным поли-Т линкером, используемым для связывания специфического 40-нуклеотидного ДНК-зонда (Agilent Technologies, http://www.chem.agilent.com ). Все наборы также включали 307 стандартных контрольных зондов Agilent. Все последовательности зондов и аннотации доступны в наборе данных S6.

Покрытие массива.

Наш набор зондов микроматрицы включал один или несколько специфичных для группы зондов для 649 из 950 таксономических групп в prokMSA и видоспецифических зондов для 1590 видов бактерий и 39 видов архей.Взятые вместе, эти зонды гарантировали, что 15 406 (94%) из 16 437 видов, представленных в базе данных prokMSA, имели по крайней мере один репрезентативный зонд на каком-то уровне дерева от типа к виду, а большинство видов prokMSA (74%) имели репрезентативные зонды на несколько таксономических уровней (в среднем 2,4 уровня на вид).

Объекты исследования и сбор образцов.

Тринадцать здоровых беременных женщин были набраны в Медицинском центре Стэнфордского университета. Все участники исследования, в том числе 14 младенцев (одна пара разнояйцевых близнецов), девять отцов, 13 матерей и двое братьев и сестер (в возрасте 1-2 лет) дали информированное согласие или получили согласие своих родителей.Дизайн исследования был одобрен административной комиссией Стэнфордского университета по медицинским исследованиям на людях. На 36–40 неделе беременности вагинальные мазки (Copan Diagnostics, http://www.copanusa.com) были получены от десяти из 13 матерей и немедленно заморожены при –20 ° C. После рождения родители брали образцы стула младенцев с помощью пробирок для сбора стула (Sarstedt, http://www.sarstedt.com/php/main.php), которые содержали ложку для стандартизированного сбора примерно 300 мг материала.Образцы детского стула были собраны в соответствии с предписанным графиком (таблица 1) и немедленно помещены в домашние морозильные камеры. Образец стула матери «нулевого дня» был взят в течение 0–5 дней после родов. Образцы стула были доставлены на льду в лабораторию для обработки через 2 недели, 3 месяца и 6 месяцев после рождения ребенка. Двенадцать матерей предоставили образцы грудного молока (~ 20 мл) через 3–9 месяцев после родов, а одна из них также предоставила грудное молоко через 6 дней после родов; эти образцы собирали в пробирки объемом 50 мл и немедленно замораживали.Девять из исследуемых семей также предоставили образцы стула одновременно от матери, отца и ребенка через 12–17 месяцев после рождения ребенка. По прибытии в лабораторию все образцы были немедленно перенесены в морозильную камеру -80 ° C и хранились там до обработки. Всего было собрано 548 образцов, в том числе 471 образец стула у младенцев, 39 образцов стула от матерей, 9 образцов стула от отцов, 2 образца стула от братьев и сестер, 16 образцов грудного молока и 11 вагинальных мазков. Родителям было поручено вести дневник, фиксируя ключевые события в категориях болезней, лекарств, изменения диеты и путешествий.Таблица 2 содержит выбранную информацию для каждого ребенка (например, пол и способ родов).

экстракция ДНК и амплификация рДНК SSU.

ДНК

экстрагировали из образцов стула с помощью мини-набора QIAamp Stool DNA (Qiagen, http://www1.qiagen.com). Вагинальные мазки обрабатывали с использованием мини-набора QIAamp DNA (Qiagen). Образцы молока сначала концентрировали вращением 2 мл в микроцентрифуге в течение 10 мин при 5000 g, из которых удаляли 1800 мкл супернатанта. Осадок ресуспендировали в 200 мкл оставшегося супернатанта, и ДНК экстрагировали с помощью мини-набора QIAamp DNA.Образцы обрабатывали партиями примерно по 16, и в каждый цикл включали несколько контрольных экстрактов для мониторинга загрязнения. Отношение образцов к контролю экстракции составляло 6,8 для стула, 2,8 для вагинальных мазков и 5,3 для молока.

РДНК

SSU была амплифицирована из экстрагированной ДНК с использованием бактериально-специфических праймеров широкого спектра действия Bact-8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘) [53] и T7-1391R (5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGGCGGTGTGTRCA-3) [46,5]. Эти праймеры амплифицируют приблизительно 90% или более полноразмерной бактериальной последовательности, кодирующей рРНК SSU, и обеспечивают промотор для РНК-полимеразы Т7.Смеси для ПЦР состояли из 1 × буфера II для ПЦР (Applied Biosystems, http://www.appliedbiosystems.com), 1,5 мМ MgCl ₂ , 0,05% Triton X-100, 20 мМ хлорида тетраметиламмония, 2% диметилсульфоксида, 0,1 Концентрации мМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, концентрации каждого праймера 0,4 мкМ, 2,5 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq (Applied Biosystems) и 5 ​​мкл экстрагированной ДНК в конечном объеме 50 мкл. Используемые условия ПЦР: 5 минут при 95 ° C, 20 циклов по 30 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 55 ° C и 90 секунд при 72 ° C, затем 8 минут при 72 ° C.Амплификацию проводили с использованием системы ПЦР GeneAmp 9700 (Applied Biosystems). В случаях чрезвычайно низкого выхода объединяли несколько 20-цикловых реакций. Реакции ПЦР очищали в 96-луночном формате с использованием системы на основе шариков для очистки ПЦР с переключателем заряда Invitrogen (Invitrogen, http://www.invitrogen.com) и хранили при -20 ° C.

Строительство эталонного бассейна.

Нашим общим эталоном была эквимолярная смесь ампликонов рДНК SSU из каждого образца (детский или материнский стул, вагинальное или грудное молоко), собранных до того, как субъекту исполнился 1 год.Для создания эквимолярной смеси очищенные продукты ПЦР с 20 циклами количественно определяли в 96-луночном формате с использованием набора дцДНК Quant-It PicoGreen (Molecular Probes, http://probes.invitrogen.com) и объединяли в равных количествах. Приблизительные доли рДНК SSU, полученной из стула, влагалища и молока, в полученном пуле составляли 90%, 5% и 5% соответственно. Этот пул ДНК использовали как в качестве матрицы для транскрипции in vitro (для гибридизации микроматриц), так и для создания библиотеки клонов SSU рДНК.

Анализ последовательности и таксономическая классификация клонированных продуктов ПЦР рДНК.

Контрольный пул (эквимолярная смесь ампликонов рДНК SSU из большинства образцов, описанных выше) клонировали и секвенировали, как описано ранее [15]. Мы получили 3458 высококачественных бактериальных последовательностей рДНК длиной более 800 нуклеотидов, включая 3163 двойных и 295 одиночных считываний. Эти последовательности были таксономически классифицированы с использованием классификатора Ribosomal Database Project (RDP) (обобщены в таблице 3).

Мы также клонировали и секвенировали несколько сотен ампликонов рДНК SSU (среднее значение = 342; диапазон = 125–557 адекватных последовательностей) из каждого из 12 различных индивидуальных образцов одним и тем же способом, получив в общей сложности 4100 высококачественных последовательностей длиной более 800 nt.12 секвенированных образцов состояли из десяти образцов стула (день 11 от ребенка 2; день 1 от матери ребенка 3; неделя 12 от ребенка 3; месяц 6+ от ребенка 8; день 1 и день 2B от ребенка 10; день 12 от ребенка. 12; 7 месяц от ребенка 13; 7 месяц от матери близнецов: младенцев 13 и 14; и 7 месяц от ребенка 14), один образец молока от матери близнецов 13 и 14 и один образец из влагалища от матери близнецов 13 и 14.

Каждая последовательность из этих 12 отдельных образцов была таксономически классифицирована в соответствии с таксономией prokMSA 2004 года [38] с использованием BLAST.В частности, мы использовали BLAST, чтобы найти последовательность с наибольшим количеством совпадений во всей базе данных prokMSA (также обрезанной до 8F и 1391R). Сообщали о двух самых успешных совпадениях и сравнивали их (совпадения с менее чем 600 совпадающими нуклеотидами не учитывались), и если эти два совпадения были сопоставлены с одним и тем же OTU, то последовательность была отнесена к этой OTU. Если два самых популярных совпадения различались по таксономическому коду, то последовательность классифицируется только на самом конкретном уровне, разделяемом двумя лучшими совпадениями. В случаях, когда второй лучший результат был значительно хуже (соответствует 2-му / соответствует 1-му <0.9) учитывалось только лучшее попадание. Коды prokMSA OTU явно определяют таксономическую классификацию последовательности на всех филогенетических уровнях для всех 4100 высококачественных последовательностей «индивидуальной выборки».

Маркировка и гибридизация.

Очищенные ампликоны рДНК SSU использовали в качестве матрицы для основанного на транскрипции синтеза аминоаллил-меченой одноцепочечной РНК с использованием набора для транскрипции MEGAScript T7 In Vitro (Ambion, http://www.ambion.com). Реакции транскрипции очищали в 96-луночном формате с использованием системы очистки Ambion MagMax RNA Purification и хранили при -20 ° C.Большие партии (5–10 мкг) эталонной РНК (эквимолярный пул всех образцов; см. Ниже) метили, используя сложный эфир Cy3 NHS, и хранили в течение нескольких недель для повторного использования. В день гибридизации 1 мкг каждого образца РНК метили, используя сложный эфир Cy5 NHS, как описано ранее [46]. Затем мы объединили 100 нг Cy5-меченного образца и 100 нг Cy3-меченного контрольного пула в объеме 48 мкл (в воде, свободной от нуклеаз). Затем мы добавили 2 мкл 25-кратного буфера для фрагментации Agilent и фрагментировали РНК путем нагревания при 70 ° C в течение 30 минут перед остановкой реакции, поместив ее на лед и добавив 50 мкл 2-кратного буфера для гибридизации Agilent.Непосредственно перед гибридизацией мы нагревали реакционную смесь до 95 ° C в течение 5 минут, затем охлаждали на льду перед добавлением 120 мкл 1-кратного буфера для гибридизации к 100 мкл фрагментированной меченой РНК и загружали 200 мкл этой смеси в камеру для гибридизации. (Agilent). Массивы гибридизовали при 60 ° C во вращающейся печи в течение 14–18 ч. Слайды промывали в 6 × SSC, 0,005% TritonX-102 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем в 0,1 × SSC, 0,005% TritonX-102 в течение 5 минут и немедленно сканировали с использованием сканера Agilent DNA Microarray Scanner.Промывка и сканирование проводились в среде с низким содержанием озона [59].

Нормализация данных микрочипа.

Данные были извлечены из отсканированного изображения микрочипа с использованием самой последней версии программного обеспечения Agilent Feature Extraction (версии 7.1.1–8.1.1). Необработанные значения интенсивности флуоресценции Cy5 (или Cy3) за вычетом фона для каждого зонда были нормализованы путем деления значений Cy5 (или Cy3) на медианное значение Cy5 (или Cy3) универсального зонда «UNIV2» (расширенная версия 3 ‘ПЦР праймер 1391R: 5’-GTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC-3 ‘) из соответствующего массива и умноженный на 100.На этом этапе значения варьировались от 0,01 до примерно 100; значения более 100 были редкими и возникали только тогда, когда флуоресцентный сигнал для определенного зонда был ярче, чем у универсального зонда. Нормализованные значения Cy5 были «декомпрессированы» следующей коррекцией: декомпрессированный Cy5 равен 10 в степени log ₅ нормализованной интенсивности Cy5. Эта декомпрессия корректирует нелинейную связь сигналов гибридизации с относительной численностью целевых видов, которую мы наблюдали в серии экспериментов по серийному разведению, описанных в предыдущем отчете [46].В этих экспериментах мы обнаружили, что 10-кратное изменение численности переводится примерно в 5-кратное изменение соответствующей интенсивности флуоресценции. После этого преобразования расширенный диапазон значений составлял от 0,001 до приблизительно 700. Мы использовали BLAST для прогнозирования гибридизации каждой из 3458 общих эталонных последовательностей рДНК, превышающих 800 пар оснований, используя схему взвешивания, описанную ранее [46], так что зонд с идеальным соответствием каждой последовательности будет иметь ожидание 100%, а зонды с меньшим количеством совпадений или несовершенные совпадения с последовательностями в контрольном пуле будут иметь соответственно более низкие ожидаемые значения гибридизации.Затем мы рассчитали логарифмическое (наблюдаемое / ожидаемое) отношение для каждого зонда в контексте нашей объединенной эталонной смеси образцов и применили эти поправочные коэффициенты для конкретных зондов к разуплотненным значениям Cy5.

Фильтрация микрочипов.

Анализ синтетических пулов определенного состава на микрочипах позволил нам идентифицировать плохо работающие зонды, которые затем были исключены из дальнейших анализов. Мы оценили эффективность зонда с использованием пяти синтетических пулов (четыре пула из шести уникальных продуктов ПЦР рДНК, один пул из 230 уникальных продуктов ПЦР рДНК [из [46]]) и одного биологического пула (общая ссылка, описанная выше), состав которых характеризовался следующим: глубокое секвенирование.Зонды со значениями интенсивности флуоресценции более 0,5% от интенсивности универсальных зондов, несмотря на отсутствие предсказанной гомологии последовательности (определяемой как значение совпадения-несовпадения BLAST менее 25 из возможных 40) с любым из видов в образце, были исключены. из последующих анализов. Мы также отбросили данные от зондов, которые имели наблюдаемую (декомпрессированную) интенсивность сигнала в 100 раз выше или ниже, чем ожидалось, в анализах биологического контрольного пула (как описано выше в разделе нормализации данных микрочипов).Оставшийся набор из 6381 зонда с хорошими характеристиками использовался во всех последующих анализах.

Оценка численности таксономических групп.

Для каждого образца мы получили оценку относительной численности каждой таксономической группы в нашем филогенетическом дереве с использованием алгоритма, который гарантирует, что ни один вид не вносит более одного вклада в оценку численности таксономической группы, и что нижележащие зонды (зонды, которые представляют отдельные подмножества видов, принадлежащих к этой филогенетической группе) включены в оценку совокупной численности группы.В частности, для каждой филогенетической группы в каждом образце мы отсортировали все находящиеся ниже по течению зонды в соответствии с их оценками относительной численности на основе микрочипов и рассчитали общую сумму оценок относительной численности всех неперекрывающихся зондов. В результате конкретные пробы, добавленные вместе для представления данной таксономической группы, варьировались в разных образцах, в зависимости от того, какие конкретные пробы имели наибольший сигнал гибридизации в этом образце.

Сравнение данных микрочипа и последовательностей.

Оценки относительной численности каждой группы prokMSA на каждом уровне таксономической иерархии в контрольном пуле и в 12 отдельных образцах, проанализированных с помощью секвенирования, были получены путем расчета доли последовательностей в соответствующей библиотеке рДНК, которые были назначены пользователя BLAST в эту группу. Эти основанные на последовательностях оценки численности были напрямую сопоставлены с оценками, полученными на основе данных микрочипа, как описано в предыдущем разделе.

Автокорреляционный анализ.

Мы использовали автокорреляции как способ измерения тенденции таксономической группы к сохранению после установления («липкость»). Для данного временного ряда от времени a до времени b, мы вычислили корреляцию Пирсона для каждого дочернего вектора ( a + 1,…, b ) и вектора ( a, …, b — 1), представляющий логарифмические оценки (относительной численности). Автокорреляция каждой таксономической группы затем принималась как медианная автокорреляция для всех младенцев, для которых рассматриваемая таксономическая группа присутствовала хотя бы один раз (определяемая как численность> 0.1%) в рассматриваемом временном интервале. В нашем «липком» анализе мы выполнили этот анализ отдельно для двух разных наборов образцов, собранных с разными интервалами выборки, чтобы избежать смешивающего эффекта вариации в интервалах выборки: (1) образцы раз в неделю с 1 по 12 недель; и (2) ежемесячные пробы с 1 по 6 месяцев.

Обнаружение последовательностей архей и грибов.

Для скрининга последовательностей рДНК архей и грибов. мы сначала проверили пулы, включающие все извлеченные образцы ДНК от каждого ребенка (т.е., один пул на ребенка), все образцы стула родителей, все образцы из влагалища и все образцы молока, соответственно. Для каждого пула, дающего положительный результат, все образцы компонентов затем анализировались индивидуально. Для скрининга последовательностей рДНК архей мы использовали два набора специфичных для архей праймеров с широким спектром действия: A751F и U1406R [60]; и Arch433F (5′-TCCAGGCCCTACGGG-3 ‘[61]) и Arch958R (5′-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′ [62,63]). Для скрининга грибов мы использовали специфические для грибов праймеры широкого спектра действия 817F [64] и 1536R-rev (5’-AATRCAATGCTCTATCCCCA-3 ‘, адаптировано из [64]).Смеси для ПЦР были аналогичны тем, которые использовались для описанной выше ПЦР с широким спектром бактерий, но со следующими изменениями: для ПЦР, специфичной для грибов, концентрация MgCl ₂ была увеличена до 2 мМ, а BSA был добавлен в конечной концентрации. 1 мг / мл. В реакциях ПЦР, специфичных для грибов и архей, хлорид тетраметиламмония не добавляли, а добавляли 2 мкл объединенной ДНК с конечным объемом 50 мкл. Программа цикла состояла из 5 минут при 95 ° C, 35 циклов (30 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 55 ° C и 30 секунд при 72 ° C), а затем 8 минут при 72 ° C.Реакции амплификации анализировали на агарозных гелях.

Анализ смещения амплификации.

Чтобы исследовать, могут ли несовпадения бактериальных праймеров влиять на амплификацию, ДНК была экстрагирована из пяти контрольных штаммов бактерий: Escherichia coli (клетки TOP10, Invitrogen), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Bifidobacterium longum. (ATCC 15707) и Bifidobacterium infantis (ATCC 15697) с использованием мини-набора QIAamp DNA.Концентрации ДНК измеряли с помощью УФ-спектрофотометра и корректировали для корректировки выхода ДНК, размера генома и количества копий гена рРНК SSU на геном для получения «нормализованных» ДНК, каждая из которых содержит одинаковое количество копий гена рРНК SSU на мкл. Бактериальную ДНК из лизатов амплифицировали индивидуально или парами с использованием праймеров 8F и T7-1391R, как описано выше, с использованием 20 или 35 циклов. Для парных реакций нормализованную ДНК Bifidobacterium longum смешивали с неразбавленными или серийными разведениями нормализованной ДНК из Escherichia coli, Clostridium perfringens, или Bacteroides fragilis.После амплификации смеси ПЦР очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (Qiagen) и расщепляли с использованием набора рестрикционных ферментов, выбранных для различения двух продуктов ПЦР, полученных с парными видами. Расщепления анализировали на агарозных гелях для количественной оценки относительного количества продуктов ПЦР, представляющих Bifidobacterium longum и виды в группе сравнения, соответственно.

Количественная ПЦР.

Отдельный анализ кПЦР в реальном времени использовался для амплификации и количественного определения рДНК каждой из четырех микробных групп: все бактерии, бифидобактерии, все грибы и все археи.Тотальный бактериальный КПЦР проводили с использованием смеси 10: 1 универсального прямого праймера 8FM (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ‘, адаптировано из [53]) и соответствующего прямого праймера 8FB (5′-AGGGTTCGATTCTGGCTCAG-3′, это исследование ), с обратным праймером Bact515R (5’-TTACCGCGGCKGCTGGCAC-3 ‘, адаптированным из [54]) и зондом TaqMan Bact338K (5′-FAM / CCAKACTCCTACGGGAGGCAGCAG / TAMRA-3’, адаптированным из [65]). Мы дополнили универсальный бактериальный прямой праймер прямым праймером Bifidobacterium longum, потому что анализ последовательностей рДНК SSU показал, что эта группа была особой, поскольку она имела три несовпадения с нашим прямым праймером 8FM.Пилотные исследования показали, что эта смесь праймеров позволяет сравнимую амплификацию генов рРНК SSU из репрезентативных Bifidobacteria, Bacteroides, Enterobacteria и Clostridia. КПЦР рода Bifidobacterium выполняли с использованием праймеров Bif42F [26] и Bif164R (5′-CATCCGGCATTACCACCCGTT-3 ‘, адаптировано из [66]) и зонда Bif126_Taqman [26]. Тотальную количественную ПЦР грибов проводили с использованием праймеров ITS1F-F (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ‘[67]) и ITS4-R (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ [68] и зонда TaqMan 5.8S (5’-FAM / CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATG / TAMRA-3 ‘, адаптировано из [68]. КПЦР архей выполняли с использованием праймеров Arch433F (5′-TCCAGGCCCTACGGG-3′) [61] и Arch958R (5′-YCCGGCGTTCC) [63], и зонд 515F TaqMan (5’-FAM / GTGCCAGCMGCCGCGGTAA / TAMRA-3 ‘, адаптированный из [54]). Для всех анализов qPCR каждая 20-мкл реакционная смесь содержала 1 × мастер-микс TaqMan Universal PCR (Applied Biosystems) , 0,9 мкМ каждого праймера (0,09 мкМ праймера 8FB в общем бактериальном анализе), 0,2 мкМ зонда, 1 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) и 2 мкл экстрагированной ДНК.Программа термоциклирования состояла из 95 ° C в течение 10 минут, за которыми следовали либо 40 циклов (анализы на бактерии и бифидобактерии), либо 45 циклов (анализы грибов и архей) при 95 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд, 60 ° C в течение 45 с, 65 ° C в течение 15 с и 72 ° C в течение 15 с [69]. Реакции проводили в системе обнаружения последовательностей Prism 7900HT (Applied Biosystems). Для построения стандартных кривых использовали десятикратные серийные разведения известных количеств рДНК из соответствующей микробной группы (т. Е. Бактерий, бифидобактерий, грибов или архей).Абсолютное содержание рДНК рассчитывали на основе стандартных кривых с использованием программного обеспечения SDS версии 2.1 (Applied Biosystems) с базовым уровнем, установленным на циклах 3–15 (бактериальные и бифидобактериальные анализы) или циклах 3–13 (анализы грибов и архей), а также пороге цикла. устанавливается в пределах геометрической фазы кривой усиления. Чувствительность каждого анализа составляла приблизительно 100 молекул рДНК на лунку для реакции ПЦР. Каждый реакционный планшет для количественной ПЦР включал два типа отрицательных контролей (контроль реагентов и контроль аликвот), каждый в трех экземплярах.Специфичность ПЦР-анализа на бифидобактерии в реальном времени была протестирована с использованием геномной ДНК, выделенной из 17 контрольных штаммов бактерий: Bacillus subtilis (ATCC 6633), Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Bacteroides thetaiotaomicron (ATCC 29148), Bifidobacterium longum) (ATCC 15ifidobacterium Infantis (ATCC 15697), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Clostridium putrefaciens (ATCC 25786), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (клетки TOP10; Invitrogen), Haemophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactophilus haemolyticus (ATCC 33390), Lactobacillus Lactobacillus delbrueckii (ATCC 4797), Megasphaera elsdenii (ATCC 17752), Proteus vulgaris (ATCC 13315), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) и Streptococcus salivarius (ATCC 13419).

Подтверждение подозрительных видов / таксонов.

Мы исследовали происхождение сигналов гибридизации массива, представляющих 12 видов / таксонов, присутствие которых в образцах было неожиданным и не подтвержденным последовательностями в контрольном пуле. Для каждого анализа мы использовали один или оба из двух независимых анализов. Во-первых, мы попытались амплифицировать последовательности, очевидно обнаруженные с помощью анализа массива, с использованием праймеров, специфичных для видов / таксонов; когда продукт был получен, его дополнительно анализировали путем секвенирования.Для амплификации последовательностей мы использовали праймер, идентичный 40-мерному зонду, который давал сигнал гибридизации в нашем микроматрице в качестве 5′-праймера и 40-мерную универсальную последовательность (обратный комплемент последовательности UNIV2, приведенной выше) в качестве 3′-фрагмента. грунтовка. В некоторых случаях мы также пытались амплифицировать подозрительную последовательность, используя усеченную (23-мерную) версию соответствующего олигонуклеотидного зонда из микроматрицы в паре с известным группоспецифическим праймером ПЦР от ProbeBase [55]. Все ПЦР проводили в условиях, идентичных тем, которые использовались при первоначальных амплификациях образцов для анализа микрочипов.Положительные полосы ожидаемого размера были клонированы и секвенированы. В качестве второго подхода четыре образца, которые, как было предсказано на основе результатов микроматрицы, содержали последовательности от неожиданных видов, были дополнительно проанализированы путем секвенирования библиотек клонов рДНК SSU (96–288 клонов), созданных путем амплификации с использованием широкодиапазонных бактериальных праймеров 8F и 1391R (как указано выше. ), а также клонирование и секвенирование, как описано ранее [15]. Относительная численность, предсказанная анализом микрочипов, и количество секвенированных клонов были следующими: Vibrio (13%): 96, Deinococcus (0.1%): 192, спирохет (1%): 288 и Legionella pneumophila (1%): 192.

Дополнительная информация

Набор данных S3. Нормализованные данные микрочипов для всех образцов и всех отфильтрованных зондов.

Необработанные интенсивности Cy5 преобразовывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Обратите внимание, что для образцов с повторной гибридизацией ( n = 36) показаны усредненные значения, а названия образцов обозначены (Avg).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.sd003

(19,0 МБ TXT)

Рисунок S1. Численность бактерий и бифидобактерий в течение первого года жизни

Для каждого образца ребенка общее количество бактерий и бифидобактерий оценивалось с помощью ПЦР в реальном времени TaqMan, как подробно описано в разделе «Материалы и методы». Для каждой из этих таксономических групп расчетные копии гена рРНК на грамм фекалий ( y -ось) нанесены на график как функция дней жизни (ось x —). Обе оси имеют логарифмическую шкалу.Для каждой таксономической группы измерения численности усекаются на нижнем конце диапазона до значения, соответствующего 95-му процентилю экстракционных (отрицательных) контролей для соответствующего набора праймеров ПЦР (10702 и 1183 копий рДНК на грамм эквивалента стула. для общих бактерий и бифидобактерий соответственно). Таким образом, значения, нанесенные на соответствующие нижние пределы обнаружения, обычно представляют собой численность ниже указанного значения (диапазон, включающий ноль).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.0050177.sg001

(457 КБ PDF)

Рисунок S2. Обилие фекальных бактерий, грибов и архей в течение первого года жизни

Для каждого образца младенца обилие бактерий, грибов и архей оценивалось с помощью ПЦР в реальном времени TaqMan, как подробно описано в разделе «Материалы и методы». Для каждой из этих таксономических групп расчетные копии гена рРНК на грамм фекалий ( y -ось) нанесены на график как функция дней жизни ( x -ось). Обе оси имеют логарифмическую шкалу.Для каждой таксономической группы измерения численности усекаются на нижнем конце диапазона до значения, соответствующего 95-му процентилю экстракционных (отрицательных) контролей для соответствующего набора праймеров ПЦР (10702, 9831 и ноль копий рДНК на грамм). эквивалента стула для бактерий, грибов и архей соответственно). Таким образом, значения, нанесенные на соответствующие нижние пределы обнаружения, обычно представляют собой численность ниже указанного значения (диапазон, включающий ноль). Все значения, для которых оценка численности методом qPCR была равна нулю (только для архей), были опущены.Эпизоды антибактериального или противогрибкового (нистатин) лечения обозначены на временной оси серыми или розовыми полосами соответственно (дополнительную информацию см. В Таблице 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050177.sg002

(773 КБ PDF)

Благодарности

Мы благодарим все семьи, принявшие участие в этом исследовании. Мы благодарны за помощь членов групп Брауна и Релмана, включая Стивена Поппера, Гарольда Амогана, Ле Детлефсена и Лину Веннстрём, а также за ценные советы Майкла Эйзена (Национальные лаборатории Лоуренса Беркли и Калифорнийский университет в Беркли), Роба Тибширани ( Стэнфорд) и Джерел Дэвис.Мы благодарим Карен Нельсон и Джоан Эмерсон (Институт геномных исследований) за техническую поддержку в создании и секвенировании библиотеки клонов рДНК SSU. Мы благодарим Horn Foundation за поддержку этой работы. ПОБ — исследователь Медицинского института Говарда Хьюза. DAR является лауреатом премии «Пионер» Национального института здравоохранения.

Вклад авторов

CP, EMB, DBD, DAR и POB разработали и разработали эксперименты и проанализировали данные. CP, EMB и DBD проводили эксперименты.Документ написали CP, EMB, DBD и POB.

Ссылки

1. 1. Ley RE, Backhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD и др. (2005) Ожирение изменяет микробную экологию кишечника. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 11070–11075.
2. 2. Backhed F, Ding H, Wang T, Hooper LV, Koh GY и др. (2004) Микробиота кишечника как фактор окружающей среды, регулирующий накопление жира. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 15718–15723.
3. 3. Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI (2006) Микробная экология: кишечные микробы человека, связанные с ожирением.Природа 444: 1022–1023.
4. 4. Stappenbeck TS, Hooper LV, Gordon JI (2002) Регуляция развития кишечного ангиогенеза аборигенными микробами через клетки Панета. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15451–15455.
5. 5. Сюй Дж., Гордон Дж. И. (2003) Вступительная статья: Почитай своих симбионтов. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 10452–10459.
6. 6. Hooper LV, Midtvedt T, Gordon JI (2002) Как взаимодействия между хозяином и микробом формируют питательную среду кишечника млекопитающих.Анну Рев Нутр 22: 283–307.
7. 7. MacDonald TT, Gordon JN (2005) Бактериальная регуляция кишечных иммунных ответов. Гастроэнтерол Clin North Am 34: 401–412.
8. 8. Парсоннет Дж., Фридман Г.Д., Вандерштин Д.П., Чанг Й., Фогельман Дж. Х. и др. (1991) Инфекция Helicobacter pylori и риск рака желудка. N Engl J Med 325: 1127–1131.
9. 9. Лекит М., Абачин Э., Мартин А., Пойярт С., Почарт П. и др. (2004) Иммунопролиферативное заболевание тонкого кишечника, связанное с Campylobacter jejuni.N Engl J Med 350: 239–248.
10. 10. Отт С.Дж., Мусфельдт М., Вендерот Д.Ф., Хампе Дж., Брант О. и др. (2004) Уменьшение разнообразия бактериальной микрофлоры слизистой оболочки толстой кишки у пациентов с активным воспалительным заболеванием кишечника. Кишечник 53: 685–693.
11. 11. Сексик П., Риготтье-Гойс Л., Грамет Г., Сутрен М., Покхарт П. и др. (2003) Изменения доминирующих фекальных бактериальных групп у пациентов с болезнью Крона толстой кишки. Кишечник 52: 237–242.
12. 12.Fell JM (2005) Воспалительные кишечные заболевания новорожденных: некротический энтероколит и аллергический колит. Early Hum Dev 81: 117–122.
13. 13. de la Cochetiere MF, Piloquet H, des Robert C., Darmaun D, ​​Galmiche JP, et al. (2004) Ранняя кишечная бактериальная колонизация и некротический энтероколит у недоношенных детей: предполагаемая роль Clostridium . Pediatr Res 56: 366–370.
14. 14. Vaughan EE, Schut F, Heilig HG, Zoetendal EG, de Vos WM, et al.(2000) Молекулярный взгляд на экосистему кишечника. Curr Issues Intest Microbiol 1: 1–12.
15. 15. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, et al. (2005) Разнообразие кишечной микробной флоры человека. Наука 308: 1635–1638.
16. 16. Zoetendal EG, Akkermans AD, De Vos WM (1998) Анализ гель-электрофореза в градиенте температуры 16S рРНК из образцов фекалий человека выявляет стабильные и специфичные для хозяина сообщества активных бактерий.Appl Environ Microbiol 64: 3854–3859.
17. 17. Старк П.Л., Ли А. (1982) Микробная экология толстой кишки грудных детей и детей, вскармливаемых смесями, в течение первого года жизни. J Med Microbiol 15: 189–203.
18. 18. Penders J, Thijs C, Vink C, Stelma FF, Snijders B, et al. (2006) Факторы, влияющие на состав кишечной микробиоты в раннем младенчестве. Педиатрия 118: 511–521.
19. 19. Бенно Ю., Савада К., Мицуока Т. (1984) Микрофлора кишечника младенцев: состав фекальной флоры у младенцев, находящихся на грудном и искусственном вскармливании.Microbiol Immunol 28: 975–986.
20. 20. Favier CF, Vaughan EE, De Vos WM, Akkermans AD (2002) Молекулярный мониторинг последовательности бактериальных сообществ у новорожденных людей. Appl Environ Microbiol 68: 219–226.
21. 21. Hopkins MJ, Macfarlane GT, Furrie E, Fite A, Macfarlane S (2005) Характеристика кишечных бактерий в детском стуле с использованием ПЦР в реальном времени и анализов северной гибридизации. FEMS Microbiol Ecol 54: 77–85.
22. 22. Hall MA, Cole CB, Smith SL, Fuller R, Rolles CJ (1990) Факторы, влияющие на присутствие фекальных лактобацилл в раннем младенчестве.Arch Dis Child 65: 185–188.
23. 23. Йошиока Х, Исэки К., Фудзита К. (1983) Развитие и различия кишечной флоры в неонатальном периоде у детей, находящихся на грудном и искусственном вскармливании. Педиатрия 72: 317–321.
24. 24. Harmsen HJ, Wildeboer-Veloo AC, Raangs GC, Wagendorp AA, Klijn N, et al. (2000) Анализ развития кишечной флоры у детей, находящихся на грудном и искусственном вскармливании, с использованием методов молекулярной идентификации и обнаружения. J Pediatr Gastroenterol Nutr 30: 61–67.
25. 25. Balmer SE, Wharton BA (1989) Диета и фекальная флора новорожденного: грудное молоко и детские смеси. Arch Dis Child 64: 1672–1677.
26. 26. Пендерс Дж., Винк С., Дриссен С., Лондон Н., Тиджс С. и др. (2005) Количественная оценка Bifidobacterium spp., Escherichia coli и Clostridium difficile в образцах фекалий младенцев, находящихся на грудном вскармливании и вскармливаемых смесями, с помощью ПЦР в реальном времени. FEMS Microbiol Lett 243: 141–147.
27. 27. Lundequist B, Nord CE, Winberg J (1985) Состав фекальной микрофлоры у младенцев на грудном и искусственном вскармливании от рождения до восьми недель.Acta Paediatr Scand 74: 45–51.
28. 28. Orrhage K, Nord CE (1999) Факторы, контролирующие бактериальную колонизацию кишечника у младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Acta Paediatr Suppl 88: 47–57.
29. 29. Fanaro S, Chierici R, Guerrini P, Vigi V (2003) Микрофлора кишечника в раннем младенчестве: состав и развитие. Acta Paediatr Suppl 91: 48–55.
30. 30. Bennet R, Nord CE (1987) Развитие фекальной анаэробной микрофлоры после кесарева сечения и лечения антибиотиками у новорожденных.Инфекция 15: 332–336.
31. 31. Neut C, Bezirtzoglou E, Romond C, Beerens H, Delcroix M и др. (1987) Бактериальная колонизация толстой кишки у новорожденных, рожденных путем кесарева сечения. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 266: 330–337.
32. 32. Hallstrom M, Eerola E, Vuento R, Janas M, Tammela O (2004) Влияние способа доставки и некротизирующего энтероколита на микрофлору кишечника у недоношенных детей. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 23: 463–470.
33. 33. Мандар Р., Микелсаар М. (1996) Передача микрофлоры матери новорожденному при рождении. Биол для новорожденных 69: 30–35.
34. 34. Швирц А., Грюль Б., Лобниц М., Мишель П., Радке М. и др. (2003) Развитие бактериального состава кишечника у госпитализированных недоношенных детей по сравнению с доношенными детьми, находящимися на грудном вскармливании. Pediatr Res. 54: 393–399.
35. 35. Саката Х, Йошиока Х, Фудзита К. (1985) Развитие кишечной флоры у младенцев с очень низкой массой тела при рождении по сравнению с нормальными доношенными новорожденными.Eur J Pediatr 144: 186–190.
36. 36. Миллар М.Р., Линтон К.Дж., Кейд А., Глэнси Д., Холл М. и др. (1996) Применение ПЦР гена 16S рРНК для изучения флоры кишечника недоношенных детей с некротическим энтероколитом и без него. J Clin Microbiol 34: 2506–2510.
37. 37. Коул Дж. Р., Чай Б., Марш Т. Л., Фаррис Р. Дж., Ван К. и др. (2003) Проект базы данных рибосом (RDP-II): предварительный просмотр нового средства автоматического выравнивания, которое позволяет регулярно обновлять новую таксономию прокариот. Nucl Acids Res 31: 442–443.
38. 38. ДеСантис Т.З., Дубосарский И., Мюррей С.Р., Андерсен Г.Л. (2003) Комплексное построение выровненных последовательностей для автоматизированного проектирования эффективных зондов (CASCADE-P) с использованием 16S рДНК. Биоинформатика 19: 1461–1468.
39. 39. Дедыш С.Н., Панкратов Т.А., Белова С.Е., Куличевская И.С., Лизак В. (2006) Филогенетический анализ и определение состава бактериального сообщества на кислых сфагновых торфяниках in situ. Appl Environ Microbiol 72: 2110–2117.
40. 40.Шмитт-Вагнер Д., Фридрих М.В., Вагнер Б., Брюн А. (2003) Филогенетическое разнообразие, численность и осевое распределение бактерий в кишечном тракте двух термитов, питающихся почвой (Cubitermes spp.). Appl Environ Microbiol 69: 6007–6017.
41. 41. Salzman NH, de Jong H, Paterson Y, Harmsen HJ, Welling GW и др. (2002) Анализ библиотек 16S микрофлоры желудочно-кишечного тракта мышей выявил новую большую группу кишечных бактерий мышей. Микробиология 148: 3651–3660.
42. 42. Acinas SG, Marcelino LA, Klepac-Ceraj V, Polz MF (2004) Дивергенция и избыточность последовательностей 16S рРНК в геномах с множественными оперонами rrn. J Bacteriol 186: 2629–2635.
43. 43. Park HK, Shim SS, Kim SY, Park JH, Park SE и др. (2005) Молекулярный анализ колонизированных бактерий в кишечнике новорожденного человека. J Microbiol 43: 345–353.
44. 44. Mackie RI, Sghir A, Gaskins HR (1999) Микробная экология развития желудочно-кишечного тракта новорожденных.Am J Clin Nutr 69: 1035S – 1045S.
45. 45. Macdonald TT, Monteleone G (2005) Иммунитет, воспаление и аллергия в кишечнике. Наука 307: 1920–1925.
46. 46. Палмер С., Бик Е.М., Эйзен М.Б., Экбург П.Б., Сана Т.Р. и др. (2006) Быстрое количественное определение сложных микробных популяций. Nucleic Acids Res. 34.
47. 47. Линц Б., Баллу Ф., Мудли Й., Маника А., Лю Х. и др. (2007) Африканское происхождение тесной связи между человеком и Helicobacter pylori.Природа 445: 915–918.
48. 48. Caufield PW, Saxena D, Fitch D, Li Y (2007) Популяционная структура плазмидсодержащих штаммов Streptococcus mutans, члена местной биоты человека. J Bacteriol 189: 1238–1243.
49. 49. Беленгер А., Дункан С.Х., Колдер А.Г., Холтроп Дж., Луи П. и др. (2006) Два пути метаболического перекрестного питания между Bifidobacterium adolescentis и анаэробами, продуцирующими бутират, из кишечника человека. Appl Environ Microbiol 72: 3593–3599.
50. 50. Samuel BS, Gordon JI (2006) Гуманизированная модель мышиных гнотобиотиков мутуализма хозяина-архей-бактерий. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 10011–10016.
51. 51. Зонненбург JL, Chen CT, Gordon JI (2006) Геномные и метаболические исследования воздействия пробиотиков на модельный симбионт кишечника и хозяина. PLoS Biol 4: e413 ..
52. 52. Фарук С.М., Насер И.Б., Ислам М.Дж., Фарук А.С., Гош А.Н. и др. (2005) Сезонные эпидемии холеры обратно коррелируют с распространенностью фагов холеры в окружающей среде.Proc Natl Acad Sci U S A 102: 1702–1707.
53. 53. Edwards U, Rogall T, Blocker H, Emde M, Bottger EC (1989) Выделение и прямое полное определение нуклеотидов целых генов. Характеристика гена, кодирующего рибосомную РНК 16S. Nucleic Acids Res 17: 7843–7853.
54. 54. Lane DJ, Pace B, Olsen GJ, Stahl DA, Sogin ML, et al. (1985) Быстрое определение последовательностей 16S рибосомной РНК для филогенетических анализов. Proc Natl Acad Sci U S A 82: 6955–6959.
55. 55. Loy A, Horn M, Wagner M (2003) probeBase: Интернет-ресурс для олигонуклеотидных зондов, нацеленных на рРНК. Nucleic Acids Res 31: 514–516.
56. 56. Альтшул С.Ф., Гиш В., Миллер В., Майерс Е. В., Липман Д. Д. (1990) Базовый инструмент поиска локального выравнивания. J Mol Biol 215: 403–410.
57. 57. Бик Э.М., Экбург П.Б., Гилл С.Р., Нельсон К.Е., Пурдом Э.А. и др. (2006) Молекулярный анализ бактериальной микробиоты в желудке человека. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 732–737.
58. 58. Blanchard AP, Kaiser RJ, Hood LE (1996) Матрицы олигонуклеотидов высокой плотности. Biosens Bioelectron 11: 687–690.
59. 59. Фаре Т.Л., Коффи Э.М., Дай Х., Хе Ю.Д., Кесслер Д.А. и др. (2003) Влияние атмосферного озона на качество данных микрочипов. Anal Chem 75: 4672–4675.
60. 60. Baker GC, Smith JJ, Cowan DA (2003) Обзор и повторный анализ доменно-специфичных праймеров 16S. J Microbiol Methods 55: 541–555.
61. 61. Лепп П.В., Бриниг М.М., Оуверни С.К., Палм К., Армитаж Г.К. и др.(2004) Метаногенные археи и пародонтоз человека. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 6176–6181.
62. 62. DeLong EF, Wickham GS, Pace NR (1989) Филогенетические красители: зонды на основе рибосомной РНК для идентификации одиночных клеток. Наука 243: 1360–1363.
63. 63. Делонг Е.Ф. (1992) Археи в прибрежной морской среде. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 5685–5689.
64. 64. Borneman J, Hartin RJ (2000) Праймеры для ПЦР, которые амплифицируют гены рРНК грибов из образцов окружающей среды.Appl Environ Microbiol 66: 4356–4360.
65. 65. Аманн Р.И., Биндер Б.Дж., Олсон Р.Дж., Чисхолм С.В., Деверо Р. и др. (1990) Комбинация олигонуклеотидных зондов, нацеленных на 16S рРНК, с проточной цитометрией для анализа смешанных микробных популяций. Appl Environ Microbiol 56: 1919–1925.
66. 66. Langendijk PS, Schut F, Jansen GJ, Raangs GC, Kamphuis GR, et al. (1995) Количественная флуоресцентная гибридизация in situ Bifidobacterium spp. с геноспецифическими зондами, нацеленными на 16S рРНК, и их применением в образцах фекалий.Appl Environ Microbiol 61: 3069–3075.
67. 67. Gardes M, Bruns TD (1993) Праймеры ITS с повышенной специфичностью в отношении базидиомицетов — применение для идентификации микоризы и ржавчины. Мол Экол 2: 113–118.
68. 68. White TJ, Burns T, Lee S, Taylor J (1990) Амплификация и секвенирование генов грибковой рибосомной РНК для филогенетики. В: Иннис М.А., Гельфанд Д.Х., Снинский Дж. Дж., Уайт Т. Дж., Редакторы. Протоколы ПЦР. Руководство по методам и приложениям.

    No related posts.